本发明专利技术提供用于产生和冷藏树突细胞的组合物和方法，产生了更有效的DC基抗肿瘤疫苗，所述树突细胞具有产生较强信号给T细胞的优异能力。本发明专利技术包括成熟的、由Toll样受体激动剂活化的负载抗原的DC，所述Toll样受体激动剂诱发临床上有效的免疫应答，优选在用于疾病过程的早期时。本发明专利技术的DC产生期望水平的细胞因子和趋化因子，而且还具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。细胞可以被冷藏，并被解冻以待后用，从而在疫苗生产期间减少对重复提取和冲洗过程的需要。这些方法也可用于直接靶向致癌信号传导通道和癌干细胞中涉及的分子。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景癌症研究已经取得了明显进步，这些进步使得许多类型的恶性肿瘤的死亡率稳定下降。这种死亡率的下降已经受到早期检测的改进、先进的外科手术技术和新治疗干预的应用的影响。鉴于在降低癌症相关死亡率中的成功，研究已经转向了以针对癌症的新型靶向治疗为中心，其中疫苗的开发已经处于最前沿。疫苗在降低由病原体导致的死亡率中是高度有效的，这是因为它们激活免疫系统和赋予外源抗原免疫性的能力。不仅有效地接种疫苗有助于降低死亡率，而且疫苗引起长期的免疫性，该免疫性保护免受多发性感染。正是疫苗发展免疫性的这种能力最初引起开发癌症疫苗的兴趣。显然，所有形式的癌症疫苗在诱导针对为靶选择的肿瘤抗原的免疫应答中已经显示至少一定程度的成功。 虽然癌症疫苗在用作单一疗法时，尤其是在晚期疾病情况中，一般是令人失望的(Terrando 等，2007，Vaccine 25，4-16 ；Burgdorf 等，2008，Oncol. Rep. 20 (6)，1305 - 1311)，但最近的研究表明树突细胞(DC)疫苗可能影响患者的生存。当前，用于免疫治疗的方法通常结合体外刺激的抗原呈递细胞(APC)，其中DC前体在从患者收集后立即进行培养，然后负载抗原的DC在收获后被尽快输注到患者中。这种方法造成了时间约束，其不仅限制DC的潜在治疗用途，而且还使免疫治疗过程中在多个时间点从患者提取产物成为必要。除了抗原呈递之外，据认为DC在成熟后通过以细胞因子和趋化因子的方式产生各种信号分子，能进一步影响免疫应答。然而，之前的DC免疫治疗方法并不利用成熟的DC。 此外，之前关于DC的成熟的工作并不充分最佳化成熟过程以利用DC信号产生。因为负载抗原的、成熟DC已经加工了抗原，并且具有将抗原递呈到免疫细胞的能力，这些细胞在活化后不仅能快速产生抗原特异性免疫应答，而且，它们也能产生信号，以进一步实现免疫应答。毫无疑问，负载抗原的、成熟DC的有效冷藏能使方法快速产生功能上有效的细胞，用于免疫治疗。这种细胞的冷藏尚未被有效证明。因此，在本领域中，对以保持新产生的DC的有效抗原呈递和信号分泌特征的方式冷藏活化的DC的有效和定向的方法存在长期的需求。本专利技术满足该需要。
技术实现思路
本专利技术包括产生负载抗原的、活化的树突细胞(DC)以用于免疫治疗的方法，所述方法包括装载至少一种抗原到DC中；用至少一种TLR激动剂活化所述DC ;冷藏(或深低温保藏，cryopreserve)所述DC ;和解冻(或融化)所述DC ;其中所述DC产生有效量的至少一种细胞因子，以产生T细胞应答。在一个实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在另一实施方式中，抗原是微生物抗原。在再一实施方式中，TLR激动剂是LPS。在再一实施方式中，冷藏包括在约-70°C或更低的温度下冷冻所述DC。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约70%。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约80%。在再一实施方式中，DC被冷藏至少约一周。在再一实施方式中，细胞因子是IL12。在再一实施方式中，DC显示杀伤作用，由此所述DC能够裂解靶向的癌细胞。本专利技术还包括在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括将之前冷藏的组合物施用到需要其的哺乳动物中，所述组合物包括负载抗原的、活化的DC，其中所述DC负载抗原，并在冷藏前被活化。在一个实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在另一实施方式中，抗原是微生物抗原。在再一实施方式中，TLR激动剂是LPS。在再一实施方式中，冷藏包括在约-70°c或更低的温度下冷冻所述DC。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约70%。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约80%。在再一实施方式中，DC被冷藏至少约一周。在再一实施方式中，细胞因子是IL12。在再一实施方式中，DC显示杀伤作用，由此所述DC能够裂解靶向的癌细胞。本专利技术还包括用于在哺乳动物中引起免疫应答的可保存组合物，该组合物包括 负载有至少一种抗原的DC ;其中所述DC已通过暴露于至少一种TLR激动剂而被活化；和， 其中所述DC产生有效量的至少一种细胞因子，以产生T细胞应答，无论所述组合物是否已经被冷藏。在一个实施方式中，抗原是肿瘤抗原。在另一实施方式中，抗原是微生物抗原。在再一实施方式中，TLR激动剂是LPS。在再一实施方式中，组合物在约-70°C或更低的温度下被冷藏。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约70%。在再一实施方式中，解冻后DC的回收和存活率大于或等于约80%。在再一实施方式中，组合物被冷藏至少约一周。在再一实施方式中，细胞因子是IL12。在再一实施方式中，DC显示杀伤作用，由此所述DC能够裂解靶向的癌细胞。附图简介为了阐释本专利技术，在附图中描述了本专利技术的某些实施方式。然而，本专利技术并不限于附图中所描述的实施方式的精确排列和手段。图I比较常规DC (vac-DC)和ICAIT-DC产生细胞因子和趋化因子组，以及由此这些细胞能够裂解乳腺癌细胞系的杀伤作用。图2描述常规成熟的DC和ICAIT-DC均成功敏化针对肿瘤抗原的T细胞，但仅 ICAIT-DC调节T细胞真正识别表达HER-2的肿瘤。图3——包括图3A和3B——描述新鲜的ICAIT-DC对比冷藏并解冻的ICAIT-DC的可比较的存活率和回收率。利用锥虫蓝排除，在冷藏前和解冻并洗涤(通过离心)冷藏的细胞后立即测定冷藏的ICAIT DC的存活率和回收率。图3A描述二批处理组的三个单例， 而图3B描述二批处理组的两个单例。存活率在新鲜制备和冷藏的DCl中是具有可比性的。 冷藏的DCl的回收率通常在80-90%之间，比新鲜制备的DCl好得多，这是由于通过收获新鲜制备的DCl而损失了细胞。图4——包括图4A-4F——描述DCl从冷藏解冻后优异的IL12生产水平。信号3 的继续产生(IL12)通过ELISA分析来测量。图4A描述在新鲜和冷藏的细胞因子介导的 DC(CMDC)中的IL12的产量远远少于在新鲜DCl和冷藏的DCl中观察到的IL12的产量。图 4B描述在冷藏前、解冻后两小时后和解冻后12小时时，在DCl中的IL12的产量。图4C-4F 描述冷藏的DCl与从冷藏的单核细胞制备的DCl的IL12产量的比较。图5描述在冷藏的DCl中与来自冷藏的单核细胞的DCl中测量的IFN Y水平的比较。纯化的异源⑶4细胞(I X IO6/孔)的两个样品与冷藏的TLR激动剂刺激的DC (I X IO5/ 孔)共同培养，与从冷藏的单核细胞制备的DCl比较。9天以后，收获T细胞并在涂有抗CD3 和抗⑶28抗体的板上再刺激。24小时后，在上清液中分析IFNy水平(由T细胞产生)。图6描述CD4+CD25+T细胞在不成熟的、但不是DCl的树突细胞存在下抑制反应淋巴细胞增殖。2. 5 X IO5个CFSE标记的未分级的(unfractionated)反应淋巴细胞与IXlO5 个不成熟树突细胞(iDC)、成熟的树突细胞——利用IFN- Y /LPS (LPS活化的DC)、或成熟的树突细胞——利用常规细胞因子混合物(CMM)，共同培养5天。I. 25X IO5个储存的、分级的 ⑶4+⑶25+T细胞(U如所指明地被包括在内。针对⑶4-级(gated)和⑶8-级的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.03.15 US 61/313,9841.产生负载抗原的、活化的树突细胞(DC)以用于免疫治疗的方法，包括装载至少一种抗原到DC中；用至少一种TLR激动剂活化所述DC ；冷藏所述DC ;和 解冻所述DC ；其中所述DC产生有效量的至少一种细胞因子，以产生T细胞应答。2.权利要求I所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。3.权利要求I所述的方法，其中所述抗原是微生物抗原。4.权利要求I所述的方法，其中所述TLR激动剂是LPS。5.权利要求I所述的方法，其中所述冷藏包括在约_70°C或更低的温度下冷冻所述DC。6.权利要求I所述的方法，其中所述DC在解冻后的回收和存活率大于或等于约70%。7.权利要求I所述的方法，其中所述DC在解冻后的回收和存活率大于或等于约80%。8.权利要求I所述的方法，其中所述DC被冷藏至少约一周。9.权利要求I所述的方法，其中所述细胞因子是IL12。10.权利要求I所述的方法，其中所述DC显示杀伤作用，由此所述DC能够裂解靶向的癌细胞。11.在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包括将之前冷藏的组合物施用到需 要其的哺乳动物中，所述组合物包括负载抗原的、活化的DC，其中所述DC装载抗原并在冷 藏前被活化。12.权利要求11所述的方法，其中所述抗原是肿瘤抗原。13.权利要求11所述的方法，其中所述抗原是微生物抗原。14.权利要求11所述的方法，其中所述TLR激动剂是LPS。15.权利要求11所述的方法，其中所述冷藏包括在...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·J·茨尔尼基，U·科尔多夫斯基，S·许，G·K·柯斯基，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学董事会，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。