一种半成熟树突状细胞的体外制备方法技术

本发明专利技术公开了一种半成熟树突状细胞的体外制备方法，具体为收集小鼠骨髓细胞悬液，离心，裂解，细胞重悬于RPMI?1640完全培养基中，加入10-20μg/L?rmGM-CSF、2.5-10μg/L?rmIL-4和1-5mg/L?Jagged-1/Fc，孵育，收集疏松贴壁细胞，用完全培养基重悬细胞，加入等剂量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged-1/Fc，收集疏松贴壁细胞，第6-8d加入半剂量的rmGM-CSF和rmIL-4，等剂量Jagged-1/Fc，第10-12d收获疏松贴壁细胞，即semi-mature?DCsJagged-1。这种细胞只用Jagged-1/Fc处理，能导致同种异基因淋巴细胞免疫应答的能力减弱，有利于诱导免疫耐受。

In vitro preparation method of immature dendritic cell

The invention discloses a preparation method of in vitro semi mature dendritic cells, bone marrow cells were collected for specific suspension, cracking, centrifugation, cells were resuspended in RPMI? 1640 complete medium, adding 10-20 g/L? RmGM-CSF, 2.5-10 g/L and 1-5mg/L rmIL-4?? Jagged-1/Fc, incubation, collection of loose stickers the cells, cells with complete medium heavy suspension, adding dose of rmGM-CSF, rmIL-4 and Jagged-1/Fc, from loose adherent cells, the 6-8d with half dose rmGM-CSF and rmIL-4 dose of Jagged-1/Fc, the 10-12d harvest loose adherent cells, namely semi-mature DCsJagged-1?. This cell, treated only with Jagged-1/Fc, can reduce the ability of allogeneic lymphocyte immune responses to induce immune tolerance.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物学和医学
，特别涉及一种半成熟树突状细胞的制备方法。
技术介绍
树突状细胞(DCs)是构成机体细胞免疫的两大核心之一，不同树突状细胞亚型指导不同效应性T细胞的分化，从而决定着机体免疫系统在识别外来抗原中行使免疫应答抑或免疫耐受两种截然不同的功能。大量研究已证明不成熟树突状细胞(iDCs)，完全成熟树突状细胞(mDCs)和半成熟树突状细胞(semi-mature DCs)在介导机体免疫系统行使免疫耐受还是免疫应答中起着完全不同的决定性作用。从解决组织、器官移植排斥和治疗自身免疫性疾病的目的出发，人们正在不懈地努力以寻找具有诱导机体免疫耐受的半成熟树突状细胞。因此，其理论意义和临床应用价值显而易见。最新报道，采用不同方法制备的半成熟树突状细胞具有不同的特性，因而有充分理由推测它们所诱导机体免疫耐受的效果及其机制也不同。迄今为止，已报道有3种不同特性的半成熟树突状细胞，即 semi-mature DCs1"0, semi-matureDCs1"5 和 semi-mature DCstnf-α及其制备方法。Sato K等通过分离人的外周血单个核细胞，用GM-CSF(50ng/ml)和IL-4(50ng/ ml)在体外培养7d，然后加入TNF-a(50ng/ml)或LPS (lOOng/ml)继续培养3d;也可用 IL-IO (50ng/ml)培养细胞 3d，然后加入 TNF_a (50ng/ml) orLPS (100ng/ml)继续培养 3d，获得 semi-mature DCsIL_10o semi-mature DCsil-1 的主要特性是 tnf-α、IL-6 和 IFN-γ 降低， MHC-II、CD80 和 CD86 也降低。Park SJ等在体外用含10ng/ml GM-CSF或0. 5% GM-CSF上清的完全培养基培养小鼠骨髓细胞，每2d用DC培养基换液，弃非粘附细胞，培养6d，即分化为骨髓来源树突状细胞(BMDCs)，之后用 50ng/ml IL-6 刺激，再加入 100ng/mlLPS、40ng/ml TNF- α 或 40 μ g/ml anti-CD40 抗体，获得 semi-mature DCsIL-6。semi-mature DCs1"5 的主要特性是 TNF-α 禾口 IL-12 降低，CD40、CD80 和 CCR7 也降低。Menges M等在体外用GM-CSF (200U/ml)或细胞系分泌的含10% GM-CSF上清诱导培养小鼠骨髓细胞分化为BMDCs，然后加入TNF-α (500U/ml), LPS (1 μ g/ml)或LPS联合 anti-CD40 抗体(5 μ g/ml)培养 24h，即获得 semi-mature DCstnf^α。semi-mature DCstnf^α 的主要特性是TNF- α、IL-6和IFN- γ降低，而MHC-II、CD80和CD86则升高。以上可见，采用不同方法制备的半成熟树突状细胞具有不同的细胞表型特性和产生不同水平的细胞因子，因而提示它们所诱导机体免疫耐受的效果及其机制迥异，确切功能仍有待证实。其中，有的需要分别用诱导成熟和抑制成熟的两种因素或多种因素去处理 iDCs，以致制备技术较繁，又因依赖于两种作用完全相反的因素导致树突状细胞的半成熟程度难以控制，DCs分化的机制及功能也就不同。因此，我们探索单因素控制的新型半成熟树突状细胞亚群的制备技术。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供，包括以下步骤(1)冰浴上收集小鼠骨髓细胞悬液，离心弃上清；(2)将步骤(1)离心得到的细胞重悬于磷酸缓冲液(PBS)中，加入细胞悬液体积 15-20倍的红细胞裂解液，37. 0°C避光作用8-lOmin，然后离心；(3)将步骤(2)离心得到的细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基中；(4)在步骤(3)得到的细胞悬液中加入10-20 μ g/L重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、2. 5-10 μ g/L重组小鼠白细胞介素4 (rmIL-4)和l_5mg/L重组嵌合蛋白(Jagged-1/Fc)；(5)置于培养箱中孵育；(6)隔天1次，重复以下操作去除上层悬浮细胞，收集疏松贴壁细胞，离心弃上清，然后用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基重悬离心得到的细胞，加入同步骤(4) 等剂量的rmGM-CSF、rmIL-4和Jagged-1/Fc，然后置于培养箱中继续孵育；(7)第6-8d开始，加入与步骤(4)相比半剂量的rmGM-CSF和rmIL-4，Jagged-I/ Fc剂量不变，其余同步骤(6)；(8)第10-12d弃底层牢固贴壁细胞，收获疏松贴壁细胞，即Jagged-I诱导的半成熟树突状细胞(semi-mature DCsjagged"1)。所述步骤(1)、(6)中离心条件为4°〇，300\8，离心3_5111土11。所述步骤O)中磷酸缓冲液的加入量为能重悬细胞的最小体积。所述步骤(2)中离心时用冷PBS作为洗涤溶液，离心洗涤3次，离心条件均为4°C， 300 X g，离心 3-5min。所述步骤(3)中细胞重悬后细胞密度为2-5X109/L。所述步骤(5)、(6)、(7)中培养箱内条件为37. 0°C、5% CO2。本专利技术的机理业已证明Jagged-I是存在于哺乳动物细胞Notch受体的主要配体之一，为单次跨膜糖蛋白，在骨髓、胎儿肝基质细胞、胸腺上皮细胞等均有表达。 Jagged-I-Notch信号在维持造血干/祖细胞和胸腺细胞向T、B和NK细胞发育分化中发挥十分重要的作用。另发现树突状细胞(DCs)和T淋巴细胞表面均存在Notch受体和 Jagged-I配体的表达，推测Jagged-I-Notch信号可能调控DCs的分化成熟，又因这两种细胞表面互有Notch受体和Jagged-I配体，设想两种细胞间配体与受体的相互结合为DCs和 T淋巴细胞相互作用实现细胞间的信息交流，从而为指导T细胞分化提供了物质基础。本专利技术正是基于上述Jagged-I调控细胞发育分化的特性和DCs表面存在Jagged-I受体的发现来设计的。本专利技术与现有技术相比有以下优点和有益效果(1)本专利技术制备方法依赖Jagged-1/Fc处理细胞，而semi-mature DCsIL_6、 semi-mature DcslHc^nsemi-Iiiature DCstnf^α 分别依赖白细胞介素 6 (IL-6)、白细胞介素 IO(IL-IO)和肿瘤坏死因子α (TNF-α)处理细胞。(2)上述 semi-mature DCs 都以 GM-CSF和 / 或 IL-4 的诱导为基础，但 semi-mature DCsil"6和semi-mature DCs1"0的诱导需要两种因素的处理，即先用IL-6或IL-10处理细胞，然后用TNF-α或细菌脂多糖(LPS)等处理细胞，也就是需要两种或两种以上的因素联合。而 semi-mature DCsjagged"1 只用 Jagged-1/Fc 处理细胞。(3)本专利技术制备方法得到的semi-mature DCsjagged-1的特性，包括细胞表型本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种半成熟树突状细胞的体外制备方法，其特征在于包括以下步骤：（１）冰浴上收集小鼠骨髓细胞悬液，离心弃上清；（２）将步骤（１）离心得到的细胞重悬于ＰＢＳ中，加入细胞悬液体积１５－２０倍的红细胞裂解液，３７．０℃避光作用８－１０ｍｉｎ，然后离心；（３）将步骤（２）离心得到的细胞重悬于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０完全培养基中；（４）在步骤（３）得到的细胞悬液中加入１０－２０μｇ／Ｌ重组小鼠粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子ｒｍＧＭ－ＣＳＦ、２．５－１０μｇ／Ｌ重组小鼠白细胞介素４ｒｍＩＬ－４和１－５ｍｇ／Ｌ重组嵌合蛋白Ｊａｇｇｅｄ－１／Ｆｃ；（５）置于培养箱中孵育；（６）隔天１次，重复以下操作：去除上层悬浮细胞，收集疏松贴壁细胞，离心弃上清，用含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０完全培养基重悬离心得到的细胞，加入同步骤（４）等剂量的ｒｍＧＭ－ＣＳＦ、ｒｍＩＬ－４和Ｊａｇｇｅｄ－１／Ｆｃ，然后置于培养箱中继续孵育；（７）第６－８天开始，加入与步骤（４）相比半剂量的ｒｍＧＭ－ＣＳＦ和ｒｍＩＬ－４，Ｊａｇｇｅｄ－１／Ｆｃ剂量不变，其余同步骤（６）；（８）第１０－１２天弃底层牢固贴壁细胞，收获疏松贴壁细胞，即Ｊａｇｇｅｄ－１诱导的半成熟树突状细胞。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：邢飞跃，于哲，刘静，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：81