本发明专利技术公开了间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，是采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25﹪胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，并提供了该共培养体系的建立方法、应用及遗传稳定性的特征变化。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，能够观察了肿瘤微环境对MSC遗传稳定性的影响，将为进一步深入探讨肿瘤微环境中MSCs生物学性状变化及其临床应用提供技术支撑及其研究依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系及其制备方法和应用；肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性变化特征。
技术介绍
由于间充质干细胞(marrow mesenchymalstem cell, MSC)尤其是骨髓间充质干细胞(MSC)易于体外分离、扩增，具有良好的多向分化潜能，能提高组织再生修复能力，导入外源基因，肿瘤趋向性和低免疫源性等优良特征而被认为是可用于临床细胞学治疗的最佳干细胞之一。在骨科、心脏病学、血管外科、肿瘤治疗等领域都取得了显著性进展，同时也已成为理想克隆载体转染治疗基因，靶向性治疗肿瘤等。但近期研究表明，干细胞生存的微环境成分及信号通路的改变可能会导致正常的干细胞(包括MSCs)向恶性肿瘤细胞转化，并且对多种肿瘤的发生发展具有促进作用。因而MSCs在临床应用中的安全性问题日渐突出。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了快速建立的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为:间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，是采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25 %胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，其中，3天:间充质干细胞5X IO4 /孔，A549 I X IO5/孔；7天:间充质干细胞2X IO4 /孔，A549 4X IO4/孔。 进一步的，上述的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述肿瘤细胞为人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞。本专利技术的第二个目的是提供了上述间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，是将人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞接种于Transwell悬挂式培养小室的下室,将Transwell悬挂式培养小室的上室置于孔中，在Transwell悬挂式培养小室内接种间充质干细胞，然后将Transwell悬挂式培养小室的上下室的培养液相互通融，得到间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系。进一步的，上述的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，所述共培养体系的培养时间为3天、7天，37°C、饱和湿度、5%C02孵箱培养。本专利技术的第三个目的是提供了上述间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系在研究肿瘤微环境中间充质干细胞生物学性状变化研究能干的应用以及筛选可提高肿瘤微环境中间充质干细胞遗传稳定性中的应用。进一步的，上述的应用，所述肿瘤微环境中间充质干细胞可发生遗传稳定性变化，提示肺腺癌微环境引起间充质干细胞细胞增殖能力、迁移能力及遗传稳定性发生了变化，出现向类肿瘤细胞方向转化。进一步的，上述的应用，所述肿瘤细胞微环境的间充质干细胞发生形态学改变，胞核大而深染，可见病理性核分裂象，与原间充质干细胞存在明显差异；染色体核型分析显示，肿瘤细胞微环境的间充质干细胞染色体数目为亚三倍体、三倍体，有明显的染色体异堂巾O进一步的，上述的应用，所述肿瘤细胞微环境的间充质干细胞，其细胞克隆形成率明显增多，细胞迁移能力明显改变；激光共聚焦结果显示，间充质干细胞细胞微丝呈束状或放射状聚集在细胞的突起和胞质内；共培养组细胞微丝走行不规则，与A549细胞相似，镜下可见丝足，Western blot结果显不，肿瘤细胞微环境的MSC p53、p62、Bcl_2、Bax、capase-3、HDAC4、MMP-2、MMP-9 HDAC4 表达量较原 MSC 高表达。本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，能够观察了肿瘤微环境对MSC遗传稳定性的影响，将为进一步深入探讨肿瘤微环境中MSCs生物学性状变化及其临床应用提供技术支撑及其研究依据。肿瘤细胞微环境的MSC发生形态学改变，胞核大而深染，可见病理性核分裂象，与原MSC存在明显差异；染色体核型分析显示，肿瘤细胞微环境的MSC染色体数目为亚三倍体、三倍体，有明显的染色体异常；细胞克隆形成率明显增多，细胞迁移能力明显改变；激光共聚焦结果显示，MSC细胞微丝呈束状或放射状聚集在细胞的突起和胞质内；共培养组细胞微丝走行不规则，与A549细胞相似,镜下可见丝足。Western blot结果显示,肿瘤细胞微环境的 MSC p53、p62、Bcl-2、Bax、capase-3、HDAC4、MMP -2、MMP_9 HDAC4 表达量较原MSC高表达。提示肺腺癌微环境引起MSC细胞增殖能力、迁移能力及遗传稳定性发生了变化，出现向类肿瘤细胞方向转化。附图说明图1为各组细胞形态观察(X 100)。图2为流式细胞仪检测细胞周期的结果。图3为各组细胞生长曲线的变化图。图4为三组细胞生长曲线图。其中，*ρ〈0.0I 为与 HMSC-bm 相比；Λ ρ〈0.0I 为与 Α549 相比。图5为用染色体图像分析仪进行核型及G显带分析结果图。其中，各组染色体核型分别是:Α:HMSC-bm (46，XX) ；B:C0-HMSC-bm (70，XX) ；C:A549 (69，XXY)。图6为ECL免疫印迹化学发光试剂经凝胶成像仪显影图。具体实施例方式实施例1: 细胞培养液的组成:DMEM/F12完全培养基(含10%FBS) (Hyclone，美国);间充质干细胞与A549均为标准细胞株。一.方法: (一)间充质干细胞(MSC)与肿瘤细胞共培养3天、7天细胞生物学活性1、方法: 1.1间充质干细胞(MSC)与肿瘤细胞共培养3天、7天 共培养体系的建立及分组: 采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25 %胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，实验组将A549接种于Transwell共培养系统的下室，再将Transwell的上室置于孔中，在Transwell小室内接种MSC，让上下室的培养液相互通融，从而建立起MSC与A549的共培养体系；对照组MSC以MSC单独接种于Transwell小室内，下层为基础培养液；对照组A549以A549单独接种于下层，Transwell小室内为基础培养液。共培养3天、7天后终止培养，收集细胞移到培养瓶中继续培养，传代至第3代、第5代细胞用于实验。实验分组及各组细胞种植密度见表I。本文档来自技高网...
【技术保护点】
间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，其特征在于，是采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25﹪胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，其中，3天：间充质干细胞5×104?/孔，A549?1×105?/孔；7天：间充质干细胞2×104?/孔，A549?4×104?/孔。
【技术特征摘要】
1.间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，其特征在于，是采用具有PET膜的Transwell悬挂式培养小室结合6孔板进行非接触共培养，取对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，计数、调整细胞密度后接种，其中，3天:间充质干细胞5X104/孔，A549 1 X 105/孔；7 天:间充质干细胞 2X 104/孔，A549 4X 104 /孔。2.根据权利要求1所述的间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系，其特征在于，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞；所述肿瘤细胞为人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞。3.间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，其特征在于，是将人体肺腺癌上皮细胞系A549细胞接种于Transwell悬挂式培养小室的下室,将Transwell悬挂式培养小室的上室置于孔中，在Transwell悬挂式培养小室内接种间充质干细胞，然后将Transwell悬挂式培养 小室的上下室的培养液相互通融，得到间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系。4.根据权利要求3所述的 间充质干细胞与肿瘤细胞的共培养体系的建立方法，其特征在于，所述共培养体系的培养时间为3天、7天，37°C、饱和湿度、5%C02孵箱培养。5.间充质干...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘永琦，李金田，张月梅，舍雅莉，张毅，李屹，秦洁，王倩，
申请(专利权)人：甘肃中医学院，
类型：发明
国别省市：
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