建立人卵巢癌动物模型的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及建立人卵巢癌动物模型的方法。本发明专利技术要解决的技术问题是提供建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法及模型建立方法。本发明专利技术提供了建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，包括如下步骤：1）人卵巢癌细胞冻存；2）人卵巢癌冻存细胞复苏。本发明专利技术还提供了建立人卵巢癌动物模型的方法。本发明专利技术方法可用于建立人卵巢癌动物模型，并解决卵巢未见癌灶的难题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法及模型建立方法。
技术介绍
卵巢癌预后差，是导致女性因生殖系统恶性肿瘤病死率最高的癌症，因卵巢位于盆腔内位置深，发生肿瘤时无典型症状，确诊时60% 70%已属晚期，肿块已固定，出现腹水，广泛盆腔转移且卵巢癌化疗病情缓解后容易复发，5年生存率只有20% 30%。相比其他妇科肿瘤，卵巢癌早期诊断和治疗近来并无重大进展，患者生预后无明显转变。因此寻找和探索用于卵巢癌诊断和治疗的新技术，新方法变得非常重要。 动物模型是对人体肿瘤进行体内研究必不可少的工具，在建立新的治疗方法时尤为重要。目前建立的人卵巢癌裸鼠转移瘤模型大多来源于肿瘤细胞株，由于肿瘤细胞在体外培养，离开了体内环境，经过长期传代培养，消除了体内细胞与细胞之间的相互作用，不能完整模拟卵巢癌的生物学行为和自然生长过程，也会导致肿瘤细胞、生物学特性和遗传学特征的改变，由其来源的小鼠肿瘤模型的自然病程和病理类型及肿瘤表型自然不能完全代表临床患者，进而影响了实验结果的准确性和结论的可靠性，以及用于评估临床疗效与安全的权威性。国内外也有把患者癌组织直接接种到裸鼠皮下或腹腔内并形成肿瘤模型的报道。皮下接种的肿瘤虽然容易观测，但未发现有其他部位的转移灶，尤其是腹腔(广泛腹腔播散是晚期卵巢癌临床特点之一)，其应用价值受到限制。已报道的肿瘤腹腔内接种模型，虽然有腹腔内的癌灶扩散，但其卵巢本身并没有发现肿瘤转移灶，也有一定局限。因此，当前本领域急需一种能克服现有技术缺点的建立一种能真正重现临床肿瘤发生发展的人卵巢癌的动物模型的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供人卵巢癌的动物模型建立方法。本专利技术提供了建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，包括如下步骤I)人卵巢癌细胞冻存患者腹水置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液重悬，_80°C保存24h后转入液氮中长期保存；2)人卵巢癌冻存细胞复苏取冻存的肿瘤细胞在37°C水浴中解冻，解冻时间(30s，用高糖DMEM培养基(糖含量为4. 5g/L)洗涤细胞I次，300g离心5min，PBS (磷酸盐缓冲液)重悬并调整细胞浓度至f2X IOVmL ；前述所有操作均在无菌条件完成。其中，所述的冻存液为含8%v/v DMSO (二甲基亚砜)的胎牛血清。进一步的，步骤2)中PBS重悬并调整细胞浓度至107/mL。在操作开始前，患者腹水应置于冰上。本专利技术提供了，包括如下步骤在无菌条件下，将经前述方法处理后的组织材料接种至小鼠腹部；接种后第30周开始传代，第2代传代时间为92 98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3飞代传代时间为36 42天。其中，上述方法中的接种采用注射器，行腹腔注射完成。本专利技术的建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法也可以用于在模型建立后传代后肿瘤组织的处理。本专利技术所使用的小鼠为N0D/SCID小鼠，鼠龄4周，体重15 20克，雌性，饲养在四川大学实验动物中心SPF (无特定病原体)屏障系统内，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。本专利技术的有益效果 本专利技术方法通过将组织材料进行处理后再建立人卵巢癌动物模型，克服了目前人卵巢癌动物模型的种种问题，尤其是卵巢未见癌灶的难题。建立起了能稳定传代的人卵巢癌N0D/SCID小鼠动物模型，传代时间稳定，且每代的一次接种成功率达100%，鉴定结果迅速准确，远优于现有技术。经实验证明，使用本专利技术方法所建立的N0D/SCID鼠移植瘤模型再现了人卵巢癌的重要生物学特征，从病理组织学、免疫表型、分子生物学特征以及分子遗传学等方面均与供体病例基本一致，生长周期稳定。不仅解决了该肿瘤研究材料异质性的问题，同时由于模拟了该肿瘤在人体内生长情况，对该肿瘤发病的分子机制、肿瘤的演进的研究、治疗手段的探索、治疗药物的筛选及评价都有重要的实用价值，具有很好的应用前旦ο附图说明图f 5为人卵巢癌腹水瘤模型形态学观察图1、右侧为荷瘤鼠，可见腹部明显胀大，左边为正常鼠图2、腹腔内充满淡黄色腹水图3、横膈及肝表面有转移结节图4、肠系膜表面有转移结节图5、腹膜上有转移结节图6、荷瘤鼠生殖系统-子宫，输卵管，卵巢(右侧)与正常小鼠(左侧)比较图7、为人卵巢癌动物模型卵巢转移。箭头所示可见卵巢里肿瘤组织占位明显，失去正常形态组织结构图8、为人卵巢癌动物模型腹水细胞学涂片HE染色(苏木精-伊红染色)。可见细胞多数聚集成团，核深染，核质比增大图9、为人卵巢癌动物模型核型分析。可见人类肿瘤染色体特征(小鼠核型以端着丝粒为主，二者差异明显)图10、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，EMA可见胞浆阳性。图11、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，Pan-cytokeatin可见胞浆阳性。图12、为人卵巢癌腹水瘤模型免疫细胞化学检测，PCNA可见胞核阳性细胞较多，说明细胞繁殖速度较快具体实施例方式实施例1接种人卵巢癌细胞1、人卵巢癌腹水样本的采集和鉴定收集四川大学华西第二医院手术中人卵巢低分化乳头状浆液性腺癌一例。经病理形态学检查、免疫表型检测，确诊为临床上常见的人卵巢低分化乳头状浆液性腺癌IIIC期。2、实验动物 N0D/SCID小鼠，鼠龄4周，体重15_20克，雌性，饲养在四川大学实验动物中心SPF屏障系统内，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。3、肿瘤组织移植所有操作均在无菌条件完成。人卵巢癌细胞冻存患者腹水(在操作开始前，患者腹水应置于冰上。)置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液(含8%v/v DMSO的胎牛血清)重悬，_80°C保存24h后转入液氣中保存；人卵巢癌冻存细胞复苏取冻存的肿瘤细胞在37°C水浴中解冻30秒钟内，用高糖DMEM培养基(4. 5g/L)洗涤细胞I次，300g离心5min，PBS重悬并调整细胞浓度至107/mL ；酒精棉球消毒小鼠腹部皮肤，吸取细胞悬液于小鼠左下腹进针皮下穿行约O. 4cm后进入腹腔，回抽无液体后将悬液注入。每个样本接种2只小鼠。所有操作在I小时内完成，注意全程无菌操作。4、移植瘤观察及鼠间传代接种后逐日观察鼠全身情况，移植部位有无感染，移植部位皮肤有无溃破等。当见小鼠腹围明显变大时行鼠间传代1)75%酒精消毒小鼠腹部皮肤后，用ImL注射器左下腹进针。皮下穿行约O. 4cm后进入腹腔，回抽吸取腹水(即腹腔穿刺术)，直接进行鼠间传代，一只小鼠可传Γ5只(视需要而定)。2)酒精棉球消毒拟传代小鼠腹部皮肤，吸取细胞悬液于小鼠左下腹进针。皮下穿行约O. 4cm后进入腹腔，回抽无液体后将腹水注入。观察该传代荷瘤鼠全身情况，移植部位有无感染，移植部位皮肤有无溃破等。全程无菌操作。其它模型传代方法是将小鼠处死之后，再取癌组织，进行传代。本模型与其它模型相比，其优点在于原代鼠传代时，不必处死，可继续观察，反复传代，反复抽取腹水供研究用(一般可反复抽取3飞次/只)。5、移植瘤观察及鼠间传代原代移植瘤潜伏期长达26周，26周后肿瘤开始生长，第30周传代。第2代传代时间为92 98天，第3代后生长周期逐渐缩短并稳定，第3飞代传代时间为36 42天，现移植瘤已稳定传至第6代。6、接种结果一次接种成功率第6代接种5只，成功率100%。注全程无菌操作。实施例二人卵巢癌冻存细胞复苏传代实验1、细胞冻存I本文档来自技高网...

【技术保护点】
建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，其特征在于：包括如下步骤：1）人卵巢癌细胞冻存：患者腹水置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液重悬，?80℃保存24h后转入液氮中长期保存；2）人卵巢癌冻存细胞复苏：取冻存的肿瘤细胞在37℃解冻，解冻时间≤30s，用高糖DMEM培养基洗涤细胞1次，300g离心5min，PBS重悬并调整细胞浓度至1~2×107/mL；其中，高糖DMEM培养基的含糖量为4.5g/L；前述所有操作均在无菌条件完成。

【技术特征摘要】
1.建立人卵巢癌动物模型用组织的处理方法，其特征在于包括如下步骤O人卵巢癌细胞冻存患者腹水置于无菌离心管中，300g离心5min，用冻存液重悬，_80°C保存24h后转入液氮中长期保存；2)人卵巢癌冻存细胞复苏取冻存的肿瘤细胞在37°C解冻，解冻时间< 30s，用高糖 DMEM培养基洗涤细胞I次，300g离心5min，PBS重悬并调整细胞浓度至f 2 X 107/mL ;其中， 高糖DMEM培养基的含糖量为4. 5g/L ；前述所有操作均在无菌条件完成。2.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建军，刘珊玲，谢晓砚，陈新莲，王和，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：