【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于哮喘治疗药物，尤其涉及一种基于间充质干细胞源性外泌体在难治性哮喘治疗中的应用。
技术介绍
1、目前，哮喘是儿童最常见的喘息性疾病之一，是一种具有多种表型和严重程度的异质性疾病，已知其与遗传因素相关。在哮喘形成之前，气道炎症导致气道重塑，进而加剧炎症和症状。为了打破这一恶性循环，为母亲患哮喘的后代寻找方法，利用人脐带间充质干细胞来源的外泌体研究其对哮喘小鼠及哮喘母亲后代肺结构的变化，并进一步初步探讨了其机制。
2、哮喘是目前儿童最常见的慢性喘息疾病之一，严重哮喘的发病率较高儿童时期哮喘的医疗负担可能会延伸到青春期和成年期，并伴有包括肺功能异常在内的后遗症，对正常生活有强烈的影响，以淋巴细胞增多和嗜酸性粒细胞增多、杯状细胞化生、平滑肌激活和气道过度活跃为特征哮喘被广泛认为是一种慢性炎症性疾病。此外，儿童哮喘的发育规划是复杂的，直接或间接地导致了一些原因，如感染、过敏、环境和遗传因素。在这些危险因素中，母亲的哮喘是一个公认的儿童哮喘气喘和哮喘同时，它也增加了妊娠并发症的风险sly，p.d等人研究表明，哮喘母亲所生的儿童哮喘在非哮喘儿童中更常见。虽然确切的机制尚不清楚，但更早和更适当地使用吸入糖皮质类固醇(ics)来改善哮喘控制似乎是关键；然而，传统哮喘治疗的最佳效果只能控制症状，而不是治愈症状，一旦患者接触到过敏原或感染，病情可能会加重。因此，寻找一种更好的哮喘治疗方法是很重要的，它尤其可以降低患有哮喘的母亲的后代对哮喘的易感性。
3、众所周知的“细胞外囊泡(ev)”在2011年被定义为脂质双层封
4、现有技术1：使用骨髓源性干细胞(bm-mscs)的外泌体治疗哮喘
5、这项技术涉及使用骨髓源性干细胞(bm-mscs)的外泌体来治疗哮喘。这种方法的基本原理是，bm-mscs外泌的外泌体具有免疫调节和抗炎性质，它们可能对哮喘的治疗有益。
6、技术问题：
7、1.骨髓样本的获取对患者来说是一种入侵性操作，并且可能会带来疼痛和并发症。
8、2.bm-mscs的来源(即供者)可能会对治疗效果产生影响，因为各个供者之间的细胞活力和功能可能存在差异。
9、3.bm-mscs生成的外泌体可能含有不可预知的蛋白质和rna分子，这可能会引发未知的副作用。
10、现有技术2：使用皮肤源性干细胞(adscs)的外泌体治疗哮喘
11、这项技术包括使用皮肤源性干细胞(adscs)的外泌体来治疗哮喘。这种方法的基本原理是，adscs的外泌体可以促进炎症后的修复，并可能有助于哮喘的治疗。
12、技术问题：
13、1.皮肤源性干细胞的获取需要进行皮肤活检，这是一种侵入性操作，可能会给患者带来疼痛和并发症，尤其是在慢性疾病患者中。
14、2.adscs的生物学性质可能会受到供者年龄、健康状况和生活方式的影响，这可能会影响到外泌体的质量和治疗效果。
15、3.尽管adscs的外泌体在一些初步的研究中显示出治疗潜力，但是对其具体作用机制和可能的副作用仍然需要进一步研究。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于间充质干细胞源性外泌体在难治性哮喘治疗中的应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用。
3、本专利技术的另一目的在于提供一种所述基于间充质干细胞源性外泌体在哮喘治疗药物中的应用的验证方法，所述验证方法，包括以下步骤：
4、第一步，培养人脐带间充质细胞hucmscs，并通过超离心提取其外泌体hucmscs-exos；
5、第二步，通过透射电镜tem、纳米颗粒追踪器nta、westernblot和纳米流式细胞术nfcm进行验证；同时，采用pn21 c57bl/6小鼠建立慢性哮喘动物模型，按照公认的卵清蛋白ova方案建立慢性哮喘动物模型；
6、第三步，在ova暴露过程中，外泌体组小鼠连续注射hucmscs-exos，对照组小鼠注射dpbs，sham组小鼠用相同体积的dpbs代替ova；通过he、masson和pas方法验证了所有动物气道的特异性变化；
7、第四步，用免疫荧光法检测小鼠肺组织中sma-α、cc-10、ki67、spc、hopx的表达。
8、进一步，所述验证方法通过wb检测akt/mtor和rhoa/rock通路的表达变化；对hucmscs-exos进行了转录组测序。
9、进一步，所述验证方法的原代细胞培养，人脐带间充质干细胞hucmscs采用改良的外植体方法进行分离和培养，用杜尔贝科磷酸盐缓冲盐清洗脐带，纵向切开，并切除动脉和静脉；然后，将软凝胶组织解剖成1～3mm3，并单独放置在6孔板上，加入改良培养基mem-α，添加10％胎牛血清和青霉素/链霉素；将培养皿在37℃和5％co的潮湿气氛中培养10～12天；在整个潜伏期中，定期添加补充的mem-α，最终去除脐带组织；用培养基洗涤平板三次后，将塑料贴壁细胞菌落使用胰蛋白酶消化，并使用添加10％胎牛血清和青霉素/链霉素的mem-α进行培养；在第3～5代时，hucmscs在10层康宁细胞培养室中扩增。
10、进一步，所述验证方法的间细胞造血干细胞表面标记物的特征和分化能力，包括：在第5代，使用流式细胞术进行细胞表面表征，利用标记抗体建立的msc标记物的表达，选择hucmscs；具体来说，使用apc偶联的cd105、apc偶联的cd73、fitc偶联的cd90和pe偶联的cd44鉴定阳性标记，使用fitc偶联的cd11b、pe偶联的cd31鉴定阴性标记；流式细胞仪分析采用贝克曼库尔特细胞弯曲流式细胞仪，配备407nm、488nm和640nm激光器，以及cytexpert软件。
11、进一步，所述验证方法的外泌体exos的命名、收获和分离，exos指sev直径40-150nm，密度1.18g/ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.使用间充质干细胞源性外泌体(MSC-Exos)作为哮喘治疗药物的主要成分，其中，该外泌体来源于人脐带间充质干细胞(hucMSCs)。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于,其验证方法包括：
3.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法进一步包括利用Westernblot检测Akt/mTOR和RhoA/ROCK信号通路的表达变化，以及对hucMSCs-Exos进行转录组测序，用于解析其可能的分子机制。
4.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的hucMSCs的培养采用改良的外植体法进行，包括用磷酸盐缓冲盐清洗脐带、纵向切开、去除动脉和静脉、将脐带组织切割成1～3mm3的块状放在6孔板上进行培养。
5.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法利用流式细胞术对第5代hucMSCs的表面标记物进行表征，并利用相关抗体对MSC标记物表达进行确认，以此鉴定hucMSCs的干细胞性质和分化能力。
6.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的外泌体(指sEV，直径40-150n
7.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的透射电镜TEM，将sEV制备的5μL样品吸附在碳涂层网格上1分钟，栅格通过暴露在辉光放电中30秒而形成亲水性；除去多余的液体，用一滴水清洗网格；再次去除多余的液体后，用1％醋酸铀酰染色15秒；用JEM-1400FLASH透射电子显微镜TEM检测吸附的Exos。
8.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的纳米颗粒跟踪分析NTA，在纳米颗粒跟踪分析系统上，采用纳米颗粒跟踪分析NTA确定了MEx的大小和浓度分布，并进行分析；将样品装入泵浦，跟踪纳米粒子的布朗运动，同时根据Stokes-爱因斯坦方程计算纳米颗粒的粒径，根据跟踪的粒子数计算溶液中的粒子浓度；在分析前，将Exos样品用无囊泡的超纯水稀释。
9.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的外泌体标记物的特征，首先对提取的外泌体进行Westernblot分析，CD81、CD63和TSG101作为阳性标记，GM130作为阴性标记，进一步区分蛋白质聚集物和外泌体，使用纳米颗粒流式细胞术来鉴定分离的外泌体的表面标记物，用NTA测定浓度后，将样品稀释至1×107粒子/mL在DPBS中；取100μL稀释样品，室温孵育，每种抗体pe偶联CD9、pe偶联CD63和apc偶联CD81保护5μL 45分钟；在培养过程中，采用间歇性摇晃进行彻底混合。使用的流式细胞仪是Cytoflex，选择了一个405/10的过滤器，事件率设置为高水平；选择散射信号检测参数VSSC-H，并将阈值参数设置为“高度”；使用0.1μm Millex-VV注射器过滤器单元，用1％次氯酸钠溶液彻底清洗仪器，用通过Millex-VV注射器过滤器过滤的超纯水冲洗系统，光路使用粒子珠进行校准进行校准；在检测到阳性信号后，收集并记录数据，在原样品中加入0.1％的TritonX-100，然后在室温下孵育1-2分钟；对样本进行重新分析，如果阳性信号随着背景信号的增加而消失，则表明存在具有膜性结构的外泌体，而不是蛋白质聚集物。
10.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，在每个组织块0.3cm×0.3cm中，加入500μL含有0.1％苯甲基磺酰氟的裂解缓冲液，将混合物均质化，收集裂解液，离心去除沉淀；随后，将30μg提取的蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，浓度范围为10-12％；将这些蛋白质电泳转移到0.45μm的PVDF膜上，并在含有0.5‰的Triton-100和5％脱脂奶粉的PBS中封闭1小时；
...【技术特征摘要】
1.使用间充质干细胞源性外泌体(msc-exos)作为哮喘治疗药物的主要成分，其中，该外泌体来源于人脐带间充质干细胞(hucmscs)。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于,其验证方法包括：
3.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法进一步包括利用westernblot检测akt/mtor和rhoa/rock信号通路的表达变化，以及对hucmscs-exos进行转录组测序，用于解析其可能的分子机制。
4.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的hucmscs的培养采用改良的外植体法进行，包括用磷酸盐缓冲盐清洗脐带、纵向切开、去除动脉和静脉、将脐带组织切割成1～3mm3的块状放在6孔板上进行培养。
5.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法利用流式细胞术对第5代hucmscs的表面标记物进行表征，并利用相关抗体对msc标记物表达进行确认，以此鉴定hucmscs的干细胞性质和分化能力。
6.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，该验证方法的外泌体(指sev，直径40-150nm，密度1.18g/ml)的命名、收获和分离，包括在无血清培养基中培养hucmscs，然后通过连续的微分离心步骤收集外泌体。
7.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的透射电镜tem，将sev制备的5μl样品吸附在碳涂层网格上1分钟，栅格通过暴露在辉光放电中30秒而形成亲水性；除去多余的液体，用一滴水清洗网格；再次去除多余的液体后，用1％醋酸铀酰染色15秒；用jem-1400flash透射电子显微镜tem检测吸附的exos。
8.如权利要求2所述的验证方法，其特征在于,，所述验证方法的纳米颗粒跟踪分析nta，在纳米颗粒跟踪分析系统上，采用纳米颗粒跟踪分析nta确定了mex的大小和浓度分布，并进行分析；将样品...
【专利技术属性】
技术研发人员：李欣，刘瀚旻，
申请(专利权)人：四川大学华西第二医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。