PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法技术

本发明专利技术涉及动物模型技术领域，具体地说，是一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法。本发明专利技术建立了一种成年条件PHF14基因敲除的基因背景下的肾损伤后纤维化模型，为研究PHF14基因在纤维化疾病中的作用提供必备条件；与现有制作PHF14敲除的模型相比，本发明专利技术的PHF14条件敲除不会造成胚胎致死性，在成年期tamoxifen诱导敲除PHF14经验证不会造成致死后果，与未敲除组相比，敲除组肺，肝，肾无显著病变，这保证了后续急性肾损伤模型制作不受系统性疾病状态的干扰，可以单独研究该基因缺陷在肾纤维化发病机制中的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物模型
，具体地说，是一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法。
技术介绍
急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)的临床特征表现为肾功能在数天内的急剧下降。其主要病因是肾缺血再灌注损伤，脓毒症、肾毒性药物打击及肾后梗阻。AKI镜下病理通常表现为肾小管上皮细胞坏死脱落，肾小管腔内管型形成，间质炎细胞浸润。动物实验和前瞻性临床研究均发现，经历AKI打击的肾脏即使短期肾功能可以恢复，今后进展到慢性肾脏病(chronickidneydiseaseCKD)的风险也大于未发生过AKI者。由AKI进展到以肾小管间质纤维化为病理特征的CKD具体机制尚不明确，可能与AKI发生后局部修复性过程的慢性失衡及其与对抗性因子复杂的相互作用有关。这类修复性进程主要包括细胞周期在损伤后的阻滞，缺氧诱导因子的分泌，和TGF-beta信号通路的激活等。2012年Kitagawa等研究人员发现一种以血小板源性生长因子受体alpha(PDGFR-alpha)依赖性的方式调节细胞间质分泌的蛋白PHF14(NM_014660.3)，并制作了PHF14基因非条件敲除小鼠模型。动物模型证明PHF14非条件敲除具有致死性，小鼠只能在出生后存活不到24小时。死因为严重的肺纤维化造成的呼吸衰竭。尸检提示肝和肾都有明显的纤维化。体外实验证明PHF14可负向调节PDGFR-alpha的表达，从而抑制成纤维细胞的细胞外基质分泌。(KitagawaM,TakebeA,OnoY,etal.Phf14,anovelregulatorofmesenchymegrowthviaplatelet-derivedgrowthfactor(PDGF)receptor-alpha.TheJournalofbiologicalchemistry.Aug102012；287(33):27983-27996.)由此说明PHF14基因在胚胎发育阶段各器官细胞外基质形成平衡中起重要调节作用。但是关于PHF14基因在成年阶段与纤维化相关性疾病的关系目前还未阐明。为了研究该基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中所起的作用，需要一种在PHF14基因敲除背景下急性肾损伤及损伤后纤维化的动物模型的建立方法，该方法目前也未见报道。
技术实现思路
现有的制作PHF14基因敲除小鼠的方法皆为非条件性敲除，由于该基因敲除具有致死性，所以无法利用非条件敲除的小鼠模型研究该基因与成年期肾纤维化的关系。而在现有的广泛使用的肾纤维化疾病动物模型中虽可观察PHF14基因的表达变化，却无法探究其在疾病发病机制中的作用。故欲研究该基因在成年期在肾小管间质纤维化的发病过程中所起的作用，需要建立一种在成年期条件敲除PHF14基因的动物模型，在此遗传背景下进行急性肾损伤及损伤后纤维化的研究。根据实验需要，叶酸刺激性肾病模型能够模拟临床急性肾损伤病程，刺激后肾纤维化发生比例较高，并且能够连续监测肾功能。本专利技术的目的在于建立一种在成年PHF14敲除遗传背景下完全模拟临床病程的急性肾损伤且损伤后肾纤维化动物模型的方法。根据现有研究成果可知胚胎期全身敲除PHF14会造成各主要器官的明显纤维化，而在胚胎期器官形成以后的成年期敲除该基因是否有相同效果尚不可知。本专利技术证明了在器官形成以后敲除PHF14无明显病理表型，证明该基因在胚胎期的功能结论不可直接推至成年动物。然而成年期动物的肾脏遭到损伤性打击后，启动和激活了一系列修复相关基因，其中包括PHF14。在此种情形下PHF14基因功能无法表达会导致肾纤维化加剧。本专利技术的第一方面，提供一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法，包括以下步骤：A、phf14lox+/+小鼠与tamoxifen诱导Cre表达小鼠(Cre-ERTM)杂交，子一代筛选phf14lox+/-；Cre+小鼠；B、将步骤A得到的phf14lox+/-；Cre+小鼠进行自交，子二代中筛选出phf14lox+/+；Cre+小鼠；C、将步骤C得到的phf14lox+/+；Cre+小鼠饲养至8-12周，接受连续5天tamoxifen腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油(sigma)，tamoxifen在玉米油中的终浓度为7.5mg/mL；D、第6天给予叶酸溶液腹腔注射，剂量250mg/kg体重，即得所述的急性肾损伤及损伤后小管间质纤维化动物模型。所述的步骤D中叶酸溶液为叶酸溶于0.3mol/LNaHCO3中，使叶酸终浓度为10g/L。叶酸由大连美仑公司提供。采用NaHCO3作溶剂是因为叶酸是难溶于水的，其他溶剂无法溶解。采用的注射剂量过小无法诱导出来急性肾损伤，剂量过大容易致死。所述的phf14loxp+/+小鼠的制备方法可参照：HuangQ,ZhangL,WangY,etal.DepletionofPHF14,anovelhistone-bindingproteingene,causesneonatallethalityinmiceduetorespiratoryfailure.ActabiochimicaetbiophysicaSinica.Aug2013；45(8):622-633.所述的tamoxifen诱导Cre表达小鼠(Cre-ERTM)由美国JAX实验室提供(B6.Cg-Tg(Cre/Esr1)5Amc/Jmice(stock004682))。所述的筛选phf14lox+/-；Cre+小鼠和phf14lox+/+；Cre+小鼠的方法：PHF14基因与Cre基因分别鉴定，PHF14鉴定所用引物：PHF14-loxpFa3’-ctattttcttgattatagatgcag-5’(SEQIDNO.1)；PHF14-loxpRa3’-gccttctaagttccagctactag-5’(SEQIDNO.2)；PCR程序95度1min，40*(95度30s，58度30s，72度1min)，72度5min，结果判定：wt/wt＝356bp，wt/flox＝356bp+457bp，flox/flox＝457bp。Cre鉴定所用引物：CreF3‘-attgctgtcacttggtcgtggc-5’(SEQIDNO.3)；CreR3‘-ggaaaatgcttctgtccgtttgc-5’(SEQIDNO.4)；PCR程序94度5min，35*(94度20s，55度30s，72度30s)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：A、phf14lox+/+小鼠与tamoxifen诱导Cre表达小鼠杂交，子一代筛选phf14lox+/‑；Cre+小鼠；B、将步骤A得到的phf14lox+/‑；Cre+小鼠进行自交，子二代中筛选出phf14lox+/+；Cre+小鼠；C、将步骤C得到的phf14lox+/+；Cre+小鼠饲养至8‑12周，接受连续5天tamoxifen腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油，tamoxifen在玉米油中的终浓度为7.5mg/mL；D、第6天给予叶酸溶液腹腔注射，剂量250mg/kg体重，即得所述的急性肾损伤及损伤后小管间质纤维化动物模型。

【技术特征摘要】
1.一种PHF14基因敲除合并急性肾损伤及损伤后肾纤维化动物模型的建
立方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、phf14lox+/+小鼠与tamoxifen诱导Cre表达小鼠杂交，子一代筛选phf14
lox+/-；Cre+小鼠；
B、将步骤A得到的phf14lox+/-；Cre+小鼠进行自交，子二代中筛选出
phf14lox+/+；Cre+小鼠；
C、将步骤C得到的phf14lox+/+；Cre+小鼠饲养至8-12周，接受连续5
天tamoxifen腹腔注射给药，剂量3mg/40g体重，溶媒玉米油，tamoxifen在玉
米油中的终浓度为7.5mg/mL；
D、第6天给予叶酸溶液腹腔注射，剂量250mg/kg体重，即得所述的急
性肾损伤及损伤后小管间质纤维化动物模型。
2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛志国，杨博，陈思秀，陈正军，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：上海;31