一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法技术

本发明专利技术提供了一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，与以往方法不同，可为癌症患者提供精准个体化治疗选药。本发明专利技术通过控制肿瘤细胞培养液中庆大霉素和霍乱霉素的浓度，可以提高肿瘤细胞的成活率，有效维持细胞形态促进肿瘤细胞对营养物质的吸收。通过控制肿瘤细胞培养液中胰岛素与所述的EGF的浓度，可以提高肿瘤细胞的生长速率，并提高细胞活性，可以得到大量的高活性肿瘤细胞，同时使用该比例的胰岛素和生长因子可以降低胎牛血清的使用量，由于胎牛血清价格比较昂贵，使用量减少有利于节约资源，并且使用本发明专利技术培养的细胞用于药物筛选测定的用药的半数抑制浓度(IC50)误差小，可以减少检测次数。

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法。
技术介绍
肺癌是中国人死亡率最高的肿瘤，严重威胁国人的健康。中国肺癌患者在诊断时大部分(约75％)属于晚期，不能手术。主要治疗包括放射治疗，化学治疗，靶向药物治疗和免疫治疗等综合性治疗。肿瘤的精准个体化治疗是近几年提出的，即根据肿瘤个体生物信息数据，基因突变的情况，肿瘤原代细胞对各种肿瘤药物的作用效果等综合信息，为肿瘤患者选择最佳的治疗药物方案，区别于传统的经验性性治疗方案。因为传统的经验性治疗方案有多种，由于肿瘤是一种异质性疾病，同一种肿瘤的不同患者对同一种药物治疗方案的效果差异很大，每一种传统经验性肿瘤治疗方案有效率差异很大，有效率在20％至40％，无效的治疗药物方案，不能杀死肿瘤细胞，而且有很多副作用，尤其是抑制机体的免疫力，促进肿瘤细胞的扩散。基因检测在肺癌治疗选择靶向药物方面已经取得良好效果，但是只有40％左右的肺癌患者可找到靶向药物，有效率在45％-75％左右，并且在一年左右都会产生耐药。ROHS(ReprogramedorganoidBasedHigh-throughputscreening，重编程类器官高通量药物筛选，是用特殊方法将患者自己的肿瘤细胞从肿瘤组织中分离出来，在实验室保真扩增，生成大量微小肿瘤进行药物筛选的一种高通量药效检测技术，实现肿瘤患者的精准个体化治疗，这一技术有别于基因检测的技术，应用范围更广泛。为改善肿瘤患者的治疗效果带来极的希望。随着环境的恶化肺癌成为发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，近几十年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确，大量资料表明，长期大量吸烟与肺癌的发生有密切的关系。已有的研究证明：长期大量吸烟者患肺癌的概率是不吸烟者的10-20倍，开始吸烟的年龄越小，患肺癌的几率越高。此外，吸烟不仅直接影响本人的身体健康，还对周围的人群的健康产生不良的影响，导致被动吸烟者肺癌患病率明显增加。城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物有关。由于组合化学的出现和和快速发展，使得合成大量有潜在临床治疗功能的化合物速度也大为提高了，然而评估这些药物化合物的稳定性，以及对各种药物对癌细胞的治疗情况，目前常使用一些体内的评价方法，但是由于手术难度大，费用昂贵，其在药物筛选方面的应用很受限制。抗肿瘤药物的筛选是抗肿瘤药物研究工作中非常重要的环节，建立合理的筛选体系，发现新的抗肿瘤药物，是肿瘤药物研究的一项重要课题，抗肿瘤药物的筛选方法繁多，总体上分为体内和体外方法两类，每种方法各有其优点及局限性，目前尚缺少有效的技术手段用于筛选和鉴定抗肿瘤的药物。因此，建立新的快速、方便、准确、高通量和高效率的检测方法具有重要的意义。随着对肿瘤细胞凋亡机制的深入研究，药物诱导肿瘤细胞凋亡已成为目前肿瘤治疗的重要途径之一。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平或细胞水平的试验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏、快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理，在同一时间内对数以千、万计的样品进行检测，并以相应的数据库支持整个技术体系的正常运转。据有关报道，20世纪90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选7.5万个样品。而在1997年高通量筛选发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选100万个样品。到1999年，由于高通量筛选的进一步完善，每天的筛选量就高达10万种化合物。高通量药物筛选可以分成四部分：药物筛选模型、高容量的样品库、自动化工作站和高效率的数据处理系统，其中药物筛选模型是关键，高容量的样品库是药物筛选的先决条件。随着高通量药物筛选的发展，将其运用于癌症药物的筛选可以加快药物筛选时间，减少人力物力，进而减轻患者的病痛，在短时间内发现可以有效治疗的药物，例如中国专利申请201510829192.1公开了一种抗包虫药物的高通量筛选方法，其具体公开了一种利用小鼠继发性细粒棘球蚴生发层细胞进行抗包虫药物的高通量筛选方法。采用的方案是：用细粒棘球蚴原头节感染实验小鼠，建立包虫病继发感染模型8-10个月后，剖检病鼠取出其体内棘球蚴囊，分离生发层细胞并建立细胞系。调整该细胞浓度并于96孔培养板中进行铺板，利用药物作用后细胞活性变化及细胞内源物质释放情况对药物作用效果进行评价，本专利技术极大地降低了药物筛选周期，不仅待测药物的用量少，而且提高了筛选精确度，降低了筛选成本。又如，中国专利申请201110245360.4中公开了肺癌药物筛选细胞株的建立，该申请公开了一种人肺癌细胞株，还公开了该细胞株的构建方法及用途，所述的人肺癌细胞株具有高染色体整合度、高荧光强度、遗传性状稳定且对肺癌药物敏感的特点，是一种理想的研究肺癌药物筛选的模型，但是该申请对于药物的选择以及治疗效果并没有具体描述。综上，由于当今社会各种化学物质的使用以及环境污染导致癌症的的发病率越来越高，如何有效快速的选出治疗肺癌的药物提高治疗效果成为肿瘤药物研究的一项重要课题。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术旨在提供一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，包括如下步骤：(1)肺癌细胞的获取：从新鲜手术或者穿刺标本获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的肺癌细胞。(2)肺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的肺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官分散，接种384孔板，贴壁培养得到贴壁细胞；(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。上述步骤(1)中所述的消化是：用消化酶消化。所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液。上述步骤(2)中所述的培养是：将步骤(1)中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株；所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：上述成分中完全DMEM(含6-10％的胎牛血清)表示：胎牛血清与完全DMEM的体积百分比为6-10％。在一个优选实施例中，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1；优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-11∶1；再优选为，所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-10∶1。上述步骤(3)中所述的培养是：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官用消化酶进行消化，然后用肿瘤选择性培养液稀释，贴壁过夜培养；所述消化酶为0.05％胰酶-EDTA。所述的肿瘤选择性培养液为每500mL含有以下成分：在另一个优选实施方案中，所述的选择性肿瘤细胞培养液中所述的胰岛素与转铁蛋白的浓度比为1∶10-30。上述成分中RPMI1640培养基(含2-5％胎牛本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)肺癌细胞的获取：从新鲜手术或者穿刺标本获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的肺癌细胞。(2)肺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的肺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官分散，贴壁培养得到贴壁细胞；(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。

【技术特征摘要】
1.一种肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)肺癌细胞的获取：从新鲜手术或者穿刺标本获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离得到分散的肺癌细胞。(2)肺癌细胞的扩增培养：对步骤(1)中得到的肺癌细胞在实验室进行保真扩增培养，生成微小肿瘤，即得到肺癌重编程类器官；(3)肺癌细胞的贴壁培养：将步骤(2)中得到的肺癌重编程类器官分散，贴壁培养得到贴壁细胞；(4)药物筛选：将步骤(3)中制备的贴壁细胞进行候选药物处理，并检测细胞生存率，进行药物筛选。2.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的消化是：用消化酶消化，然后用为肺癌肿瘤组织4倍体积的含10％小牛血清的DMEM细胞培养液中止消化，收集消化液。3.根据权利要求2所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述消化酶由225单位/mL的胶原酶或透明质酸酶和13单位/mL的分散酶组成。4.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的扩增培养是：将步骤(1)中得到的分散肿瘤细胞置于肿瘤细胞培养液中在37℃的CO2孵箱中进行培养，培养2-3周得到肿瘤细胞株。5.根据权利要求4所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述的肿瘤细胞培养液为每500mL含有以下成分：6.根据权利要求5所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：所述的两性霉素B和氢化可的松的浓度比为9-12∶1。7.根据权利要求1所述的肺癌功能性高通量用药筛选的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的贴壁培养是：将步骤(2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永贤，
申请(专利权)人：爱克精医北京生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11