用于组织移植物去细胞化的方法技术

本发明专利技术涉及用于处理组织以产生与受体免疫相容的天然、无细胞的替代组织的材料和方法。根据本发明专利技术，用其中只使用两性洗涤剂（例如不包括阴离子洗涤剂）的洗涤液清洗收获的组织。在经两性洗涤剂提取之后，用缓冲系统洗涤组织以帮助清除细胞组分和洗涤剂。在一个实施例中，本发明专利技术涉及一种支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端和/或免疫耐受的神经移植物的替代组织。优选地，所述神经移植物保留主要的细胞外基质支架以及促进贯穿神经移植物的神经再生的生物组分。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】相关申请的交叉引用本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请US 61/794，012的权利，所述申请案全文以引证的方式并入本文中。
技术介绍
生物医学工程在开发可用于帮助愈合的组织的过程中面临许多挑战。例如，“替代”组织应促进组织再生。在这种情况下，所述新组织必须与受体组织相容以便相邻细胞接受替代物。重要地是，替代组织应克服(或避免)通常由于向生物系统添加“外来物”而引起的免疫反应。而且，替代组织应展示它所替代的组织的特性和功能。例如，替代组织应展示与原始组织类似的机械特性和结构特性，或至少不干扰原生环境。替代组织可作为支架和/或保持生物学特性以促进细胞再生。最后，替代组织不应刺激疤痕形成，疤痕形成会限制组织再生或抑制深层组织的天然功能。组织工程学的一个特别具有挑战性的实施例是制造可用于帮助切断的神经再生的神经移植物。在直接神经修复过程中，当切断的神经末端再接合(没有间置移植物)时，轴突会试图从近端神经向远端神经重新生长。由于这个原因，在神经损伤之后，远端神经经受被称为华勒氏变性(Wallerian degenerat1n)的过程，其涉及神经单元(nerveelement)(包括非功能性远端轴突及其髓鞘)的崩解和清除。部分地因为此过程，轴突碎片和髓磷脂碎片长期被认为具有减少神经再生的生长抑制作用并且可能是轴突生长的机械屏障。大量证据表明当华勒氏变性过程被推迟时神经再生变慢了。因此，人们已普遍接受神经单元的清除改善了远端神经的轴突生长。这个假定已被外推到神经移植并且使人相信为了促进轴突生长，也必须将细胞碎片从神经移植物移除。移除剩余的细胞物质也被认为是使组织中的病原体减到最少以及除去可能导致移植物免疫排斥的免疫原性物质所必需。因此，用于神经移植物的处理方法通常包括严格的去细胞化技术，甚至代价为破坏支持再生过程的细胞外基质(ECM)结构和神经移植物的完整性。神经损伤常常导致用于直接修复的干净末端(clean ends)的损失或由神经组织损伤而造成缺口。在该情况下，神经修复要求间置移植物来桥接缺失处并恢复神经连续性。例如，美国专利号为7，402, 319的专利(该专利全文并入本文中)描述了一种无细胞的神经同种异体移植物，其可以恢复神经连续性并且在合适环境下可以促使神经再生。这类神经移植物经将神经组织浸泡于含有硫代甜菜碱和阴离子表面活性洗涤剂(例如曲拉通(Triton)X-200)的若干系列溶液中而获得，所述系列溶液用于使神经组织脱去细胞。Hudson等人申请了一种含有曲拉通X-200?、硫代甜菜碱-16和硫代甜菜碱-10的用于大鼠神经的去细胞化技术，并报告了极高的提取水平。(Hudson Tff, Liu SY, SchmidtCE.Tissue Eng.10:1346-58，2004)。然而，啮齿动物神经含有单个神经束(簇)且啮齿动物神经的外神经鞘与较大动物的神经的相似性较小。较大动物(例如兔、人)的大部分神经具有嵌入于胶原性内在神经外膜(围绕神经束的结缔组织)的多个神经束。人神经的鞘和束内结构是可扩张的，且对神经完整性和渗透性(包括影响组织提取的特性)具有明显影响。因此，当应用于来自较大动物的神经时，关于啮齿动物神经的去细胞化和提取的知识是所期望的提取的最佳提示。总而言之，对改善组织替代物(特别是在神经组织环境中)仍有需要。经改善的组织替代物应维持它所替代的组织的原生结构和生物活性特征，包括例如层粘连蛋白活性，并且能够在必要时结合生物活性化合物或分子以促进快速再生，并刺激组织修复和无疤痕的再生，疤痕可减低组织可动性和完整性。专利技术简述本专利技术提供了用于制备组织移植物的新颖方法和组合物，所述组织移植物保持原生结构和完整性以及改善再生所需的生物学特性。本专利技术的组织移植物提供了一种天然替代组织或可通过简单制备步骤获得的移植物。本专利技术的方法特定地破坏免疫原性细胞组分而不会显著改变天然细胞外结构。有利地，组织保持促进移植物中细胞再生的生物学特性。原生细胞外基质(ECM)的结构被保持，具体地说，在神经移植的情况下，基膜和神经内膜/内皮细胞层保持天然和通常的原始结构。因此，在一个实施例中，本专利技术提供了一种神经移植物，其支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端并且免疫耐受。无细胞神经移植物可以是例如，同系移植物、自体移植物、同种异体移植物或异种移植物。在一个实施例中，本专利技术提供了一种制备组织替代物的方法，所述方法包括以下步骤:在没有任何离子型洗涤剂的情况下(包括任何阴离子洗涤剂)，在包含至少一种两性洗涤剂的溶液中洗涤替代组织，然后在缓冲盐的系列溶液中洗涤替代组织以除去多余的两性洗涤剂。这个方法比当前技术的方法更简单更便宜，且得到具有更好的处理特性和更好的促进再生特性的替代组织。在一个特定实施例中，根据本专利技术使用的两性洗涤剂是硫代甜菜碱-1O(SB-1O)和/或硫代甜菜碱-16 (SB-16)。本专利技术还提供一种去细胞化替代组织。在一个实施例中，替代组织可以形成为缝合处、管、片、膜或支架的一部分，以递送到受体。优选地，替代组织保留了在移植到受体之后促进再生和/或不引起免疫反应的生物组分。在另一个实施例中，本专利技术提供了用于组织替代的试剂盒，其包含去细胞化替代组织。该试剂盒还可包括一或多种用于使本专利技术的替代组织再悬浮的溶液，例如药理学可接受的缓冲无菌生理盐水溶液。此外，所述试剂盒还可包括一小瓶具有细胞或其他活性剂的溶液，其可被加入以促进组织再生(例如，施万细胞(Schwann cell)和/或细胞因子)。所述试剂盒可进一步包括说明书或小册子，给用户提供所述无细胞替代组织的详细说明。在一个特定实施例中，本专利技术提供了一种移植物，其支持轴突再生、引导轴突朝向远端神经末端并且免疫耐受。在一个实施例中，所述移植物是神经移植物。移植物可在去细胞化之前被冷冻，然后储存并搁置以冷冻使用。另一个实施例是用于不要求冷冻保藏的特别应用而制备神经移植物；在那种情况下，可使温度降低或升高，这取决于使用前储存移植物的溶液，例如包括一或多种防腐剂和/或抗微生物剂。在一个实施例中，支持再生的移植物还可包括帮助抑制受体对移植物植入的免疫反应的一或多种物质。例如，本专利技术的移植物可包括佛波酯佛波醇豆蔻乙酸酯(phorbolester phorbol myristate acetate,PMA)以在⑶4+T细胞介导的免疫反应减少的情况下促进移植物植入。【附图说明】图1苏木紫和曙红染色的兔神经组织(对照物；图Α)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2 ;图B)以及按照本专利技术的方法处理的兔神经组织(DC3 ;图C)。图2Hoescht染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2 ;图B)以及按照本专利技术的方法处理的兔神经组织(DC3 ;图C)。图3S-100免疫染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2 ;图B)以及按照本专利技术的方法处理的兔神经组织(DC3 ;图C)。图4苏丹黑染色的兔神经组织(对照物；图A)、按照Hudson等人教导的方法处理的兔神经组织(DC2 ;图B)以及按照本专利技术的方法处理的兔神经组织(DC3 ;图C)。图5NA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于使组织移植物去细胞的方法，其中所述方法包括使组织移植物与包含一定浓度的两性洗涤剂的提取组合物接触一段时间，所述接触时间足以使所述组织中的细胞破裂，且其中所述方法是在无阴离子洗涤剂的情况下进行的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·F·缪尔，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US