李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒技术

本发明专利技术公开了李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法及抗血清和试剂盒，该表达方法：从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA；采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到pGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性；构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体；转化毕赤酵母GS115菌株，诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；用Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。本发明专利技术的目的提供一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法；另一目的是提供一种抗血清；另一目的是提供一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法，本专利技术还涉及一种采用该表达外壳蛋白基因制备的抗血清；本专利技术还涉及一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。
技术介绍
李坏死环斑病毒(Plum necrosis ringspot virus, PNRSV)是我国最新颁布的进境植物的检疫性病原物，是核果类果树危险性最大的病毒之一，果树一旦受其侵染，会造成未成熟果实大量脱落、产量严重下降，并且使果实品质大幅度下降。且该病毒传播速度快，在短时间内即可能给整个国家的果树业发展带来灾难性损失。目前中国仅有局部地区有该病毒发生的报道。由于我国奉行改革开放的国策，同他国种质资源交流越来越频繁，为了防止该病毒随着种子、苗木等繁殖材料的引进而进入我国，以保护我国农业的健康和可持续发展，必须加强对该病毒的检验检疫。酶联免疫吸附分析法(ELISA)是目前灵敏较高、比较稳定且通量较高的一种成熟的检测方法，是口岸植物种苗病毒的常规检测和对多个样品的快速检测的首选方法。但由于该病毒在果树体内含量非常低，繁殖困难，因此要大量提纯该病毒并制备高效价的抗血清就变得十分困难，而且本病毒目前在我国属于检疫性病毒之列，不宜为各个检测部门提供该病毒作为阳性对照，这样就在很大程度上限制了对该病毒进行血清学检测
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用毕赤酵母表达李坏死环斑病毒外壳蛋白基因的方法；本专利技术的另一个目的是提供一种采用该表达基因制备的抗血清；本专利技术的另一个目的是提供一种李坏死环斑病毒ELISA检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于包括以下步骤A、从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA ；B、采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到PGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性；C、构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体；D、转化毕赤酵母GS115菌株,诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；Ej Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤A中提取李坏死环斑病毒的RNA具体包括以下步骤(I)取PNRSV感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成< IOOmg小份至预冷Ε· P管，取IOOmg样品加入ImlTriZOL抽提；(2) 12000rpm, 2-8°C 离心 IOmin ；(3)吸取上清液，转移至新的1. 5mlE. P管中，15_30°C放置5min ；(4)加 O. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5) I^OOOrpmJ-SO 离心 15min ；(6)吸取上清液，转移至新的1. 5mlE. P.管中，加O. 5ml异丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7) I^OOOrpmJ-SO离心 IOmin ；(8)弃去上清液，得胶体状RNA，加1-1. 5ml75%乙醇，涡旋混匀(9) 7500rpm、2-8°C离心5min，弃去上清液，留下胶体状RNA ；(10)干燥 5-10min ；(11)溶于 Rnase. free 水中，枪头打勻，55_60°C温浴 IOmin ；(12)5% Agarose胶检测，测定浓度并调至2_3μ g/μ L，_70°C储存备用。如上所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤B具体方法包括 a、RT-PCR扩增目的基因⑴引物上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC为BamHI酶切位点，TAC GTA为SnaB I酶切位点；下游引物PNRSV-R 5 ' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 '，其中 AAGCTT为Hind III酶切位点，GCGGCCGC为Not I酶切位点；在引物两端即5，及3，分别加上了 SnaB I及NotI酶切位点引物；(2)扩增体系模板RNA I μ L ；5 μ mol/L上游引物I μ L ；5μ mol/L 下游引物 IyL;扩增酶混合液 I μ L ；2 X buffer 12. 5μ L ；RNase-freeddH20至总体积25 μ L ;(3)扩增过程50°C 30min, 94。。3min, 94°C lmin, 60°C 30s, 72°C lmin, 72°C IOmin,4°C ;其中 94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次；b、基因克隆及序列测序(I)PNRSV CP 产物的回收取扩增产物在I % TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收；(2)重组质粒的构建采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒，具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 μ L回收产物，I μ LpGEM-T载体，5 μ L连接液，补充ddH20至总体积10 μ L ;16°C下反应过夜；(3)感受态细胞制备于LB培养基平板上活化DH5 α菌株，并挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5ml菌液，于IOOml LB液体培养基，37°C摇动培养2 2. 5hr,至OD600 = O. 6 O. 8时，吸取1. 5ml菌液于1. 5ml离心管中，冰浴5min,4°C下4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 μ L冰预冷的100mmol/L CaCl2重悬浮菌体,冰浴30min,4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,力口入100 μ L冰预冷的100mmol/L CaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置12 24hr备用；或加入70 μ L冰预冷的100mmol/LCaCl2和30 μ L50%甘油于_70°C保存备用；(4)重组质粒的转化及筛选从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 μ L连接产物于100 μ L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec,迅速将离心管冰浴3 5min。每管中加入800 μ LLB液体培养基(不含抗生素)，37°C下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达；采用抗生素和α -互补法筛选重组质粒；取100ml LB固体培养基加热融化，待冷却至60°C以下时，加入100 μ LAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 μ LIPTG，200mg/ml水溶液过滤除菌及40 μ LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 μ I转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr ;挑取直径约为I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液体培养基中，37°C下摇动培养12 16hr，标记后取0. 7ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于包括以下步骤：A、从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA；B、采用RT?PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到pGEM?T载体上，得到pGEM?T?PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性；C、构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体；D、转化毕赤酵母GS115菌株，诱导毕赤酵母表达外壳蛋白；E、用Western?blot检测表达蛋白大小的正确性。

【技术特征摘要】
1.一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于包括以下步骤 A、从PNRSV感病材料中提取李坏死环斑病毒的RNA； B、采用RT-PCR扩增的方法克隆李属坏死环斑病毒的外壳蛋白基因；将得到的壳蛋白基因连接到PGEM-T载体上，得到pGEM-T-PNRSV重组载体，并以序列分析确定该病毒外壳蛋白基因的序列正确性； C、构建PNRSV外壳蛋白基因真核表达载体； D、转化毕赤酵母GS115菌株,诱导毕赤酵母表达外壳蛋白； E、用Western-blot检测表达蛋白大小的正确性。2.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤A中提取李坏死环斑病毒的RNA具体包括以下步骤 (1)取PNRSV感病材料的幼嫩组织若干，液氮研磨，分装成<IOOmg小份至预冷E. P管，取IOOmg样品加入ImlTriZOL抽提；(2)12000rpm，2-8°C 离心 IOmin ； (3)吸取上清液，转移至新的1.5mlE. P管中，15-30°C放置5min ； (4)加0. 2ml 氯仿，充分抽提 8min，15_30°C放置 2_3min ；(5)I^OOOrpmJ-ST^ 离心 15min ； (6)吸取上清液，转移至新的1.5mlE. P.管中，加0. 5ml异丙醇，15_30°C放置IOmin ；(7)I^OOOrpmJ-ST^ 离心 IOmin ； (8)弃去上清液，得胶体状RNAJP1-1.5ml75%乙醇，涡旋混匀 (9)7500rpm、2-8°C离心5min，弃去上清液，留下胶体状RNA ；(10)干燥5-10min ； (11)溶于Rnase.free水中，枪头打勻，55_60°C温浴IOmin ； (12)5%Agarose胶检测，测定浓度并调至2_3ii g/y L，_70°C储存备用。3.根据权利要求1所述的一种李坏死环斑病毒外壳蛋白基因表达方法，其特征在于步骤B具体方法包括 a、RT-PCR扩增目的基因 (1)引物 上游引物PNRSV-F 5 ' -GTGGATCCTACGTAATGGTTTGCCGAATTTG-3 '，其中 GGATCC 为BamHI酶切位点，TAC GTA为SnaB I酶切位点； 下游引物PNRSV-R :5' -GGAAGCTTGCGGCCGCGATCTCAAGCAGGTC-3 ',其中 AAGCTT 为Hind III酶切位点，GCGGCCGC为Not I酶切位点； 在引物两端即5’及3’分别加上了 SnaB I及Not I酶切位点引物； (2)扩增体系模板RNAI H L·5umol/L上游引物I UL ·5y mol/L下游弓I物I PL 扩增酶混合液I P L ·2X buffer12.5叫 RNase-free ddH20至总体积 25 y L (3)扩增过程·50 0C 30min，94 °C 3min，94 °C lmin，60 °C 30s, 72 °C lmin，72 °C 10min，4 °C ;其中·94°C lmin,60°C 30s, 2°C lmin,72°C IOmin 循环 35 次； b、基因克隆及序列测序 (1)PNRSVCP产物的回收 取扩增产物在I % TBE琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕，切下目的条带，采用PCR产物回收试剂盒回收； (2)重组质粒的构建 采用pGEM-T载体进行TA克隆，构建重组质粒，具体步骤为电泳确定回收产物的纯度和浓度；向PCR管中依次加入约4 ii L回收产物，I u LpGEM-T载体，5 u L连接液，补充ddH20至总体积IOii L ;16°C下反应过夜； (3)感受态细胞制备 于LB培养基平板上活化DH5 a菌株，并挑取单菌落接种子5mlLB液体培养基中，37°C下摇动培养过夜，形成种子菌液；取此5ml菌液，于100ml LB液体培养基，37°C摇动培养·2 2. 5hr,至0D600 = 0. 6 0. 8时,吸取1. 5ml菌液于1. 5ml离心管中，冰浴5min, 4°C下·4000g离心lOmin，弃上清液，重复吸取菌液一次，沉淀用灭菌滤纸吸尽残液，加入300 u L冰预冷的100mmol/L CaCl2重悬浮菌体,冰浴30min,4°C下4000g离心IOmin,收集沉淀,加入·100 u L冰预冷的100mmol/L CaCl2重新悬浮细菌沉淀，即为感受态细胞，于4°C冰箱中放置·12 24hr备用；或加入70 ii L冰预冷的IOOmmo I/L CaCl2和30 u L50%甘油于_70°C保存备用； (4)重组质粒的转化及筛选 从_70°C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻，在超净工作台上，取10 ii L连接产物于100 ii L感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴30min，将离心管置于42°C水浴中热激90sec，迅速将离心管冰浴3 5min。每管中加入800 u LLB液体培养基(不含抗生素)，37°C下摇动培养90min，以利于细菌的复苏和质粒编码抗性基因的表达； 采用抗生素和a -互补法筛选重组质粒；取100ml LB固体培养基加热融化，待冷却至·60°C以下时，加入IOOii LAmp，混匀后分倒4个培养皿；凝固后，每皿取4 y LIPTG，200mg/ml水溶液过滤除菌及40 u LX-gal混匀后均匀涂布平板；待液体被吸收后取200 U I转化后的菌液均匀涂于上述LB平板上，正向放置30min待液体被吸收，37°C下倒置培养16 24hr ；挑取直径约为I 2mm大小的白色菌落于5ml LB液体培养基中，37°C下摇动培养12 ·16hr，标记后取0.7ml与0.3ml 50%的灭菌甘油混匀后，置_80°C下保存备用，其余菌液用于重组质粒抽提及鉴定； (5)重组质粒的抽提 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈定虎，刘恭源，杨雷亮，王勇，刘军，
申请(专利权)人：陈定虎，
类型：发明
国别省市：