HAV病毒样颗粒的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了含有甲肝病毒HAV5’-UTR基因的病毒样颗粒的制备方法。该病毒样颗粒是由MS2噬菌体编码外壳蛋白包裹HAV5’-UTR RNA的一种RNA-蛋白复合体；将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重组质粒。通过RT-RCR扩增HAV5’-UTR基因，将其克隆于pNH-MS2his中，构建原核重组表达质粒并命名为pNH-MS2his-HAV5’-UTR。将所得pNH-MS2his-HAV5’-UTR质粒转化于表达大肠杆菌BL21中进行诱导表达。采用Ni-NTA的纯化柱纯化病毒样颗粒，所得的病毒样颗粒即为含HAV5’-UTR基因的病毒样颗粒，命名为HAV5’-UTR-VLPs。本发明专利技术的HAV5’-UTR-VLPs病毒样颗粒可作为RT-PCR检测的标准品和质控品，无传染性，安全可靠、稳定性好，具有耐核糖核酸酶的特点。

Preparation method and application of HAV virus like particles

The invention discloses a preparation method of virus like particles containing hepatitis A virus HAV5 '-UTR gene. The virus like particles is a kind of complex RNA- protein MS2 phage coat protein encoding HAV5 -UTR RNA package \; beta hairpin loop structure sequence encoding histidine tag sequence into MS2 phage coat protein encoding pNH-MS2his, recombinant plasmid MS2 containing the recombinant phage coat protein histidine tag and mature enzyme protein gene expression. HAV5 '-UTR gene was amplified by RT-RCR and cloned into pNH-MS2his to construct Prokaryotic Recombinant Expression Plasmid and named pNH-MS2his-HAV5' -UTR. The obtained pNH-MS2his-HAV5 '-UTR plasmid was transformed into E.coli BL21 for expression. Purified virus like particles were purified by Ni-NTA column, and the virus like particles, which were named as HAV5 '-UTR-VLPs, were -UTR - like particles of HAV5 gene. The HAV5 '-UTR-VLPs virus like particles of the present invention can be used as the standard and the quality control products for RT-PCR detection, and the utility model has the advantages of no infectivity, safety, reliability, good stability, and resistance to ribonuclease.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有甲肝病毒HAV5’-UTR基因的病毒样颗粒的制备方法及应用。
技术介绍
甲型肝炎病毒是1973年Feinslone首先用免疫电镜技术在急性期患者的粪便中发现甲型肝炎病毒(HapatitisAvirus，HAV)。属微小RNA病毒科，新型肠道病毒72型，是一种常见的食源性疾病病毒，HAV对外界抵抗力较强，耐酸碱，室温下可生存1周，干粪中25℃能生存30天。人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，少数人表现为急性甲型肝炎，严重危害人民群众健康。甲肝病毒呈全世界分布，我国作为高发区之一，其发病率十分高。甲肝病毒主要通过食物传播，当人们生食含有甲肝病毒的食物时，极有可能因感染病毒而诱发甲型肝炎。美国曾经出现因食用冻草莓引起的甲肝暴发事件。因此，食品中甲肝病毒的快速检测对于保障公共卫生安全非常重要。目前，食品中HAV检测的常用方法有RT-PCR技术和荧光定量RT-PCR技术，为了保证检测的准确性，实验中必须设立阳性对照或质控品。通常使用病毒培养物或是由RNA逆转录得到的cDNA做标准品，但是前者存在生物安全的隐患且易被核糖核酸酶降解，后者不能体现核酸提取过程和反转录对试验的影响。本专利技术采用ArmoredRNA技术，构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：构建包裹甲肝病毒基因的假病毒标准样品，此假病毒标准样品能够避免核糖核酸酶对RNA的降解，作为质控品可以对从核酸提取至RT-PCR检测的全过程进行有效的监控。本专利技术为解决上述技术问题，将编码组氨酸标签序列插入MS2噬菌体编码外壳蛋白的β发夹环结构序列中，构建含有重组组氨酸标签的MS2噬菌体外壳蛋白和表达成熟酶蛋白基因的pNH-MS2his重组质粒。并通过RT-RCR技术扩增HAV基因，将其克隆于pNH-MS2his中，构建原核重组表达质粒pNH-MS2his-HAV。并将其转化于表达大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。结果表明，表达的重组蛋白能够自主装配形成VLPs，而且其中含有HAV的基因RNA序列，并且该RNA序列具有良好的稳定性，可以作为RNA病毒检测时的标准品和质控品用于临床及样品检测。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术设计了一组扩增HAV5’-UTR基因引物，序列如下：HAV-UTRf1：ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；HAV-UTRr1：AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；5‘端和3’端分别加上HindIII和NotI酶切位点。本专利技术提供一种pNH-MS2his重组质粒，pNH-MS2his重组质粒中插入的的HAV5’-UTR基因片段序列如下：TCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTCCCTGTCCTTCCCCTATTTCCCCTTGTTTTGTTTGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTTAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTCTGTCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCATGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACGCAGATGTTTGGGACGTCGCCTTGCAGTGTTAACTTGGCTCTCATGAACCTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGGCTCTCATCCAGTGGATGCATTGAGTGAATTGATTGTCAGGGCTGTCTCTAGGTTTAATCTCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTATTTGGCCTTAAATGGGATCCTGTGAGAGGGGGTCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTGTTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTCCTCAT。本专利技术还提供一种制备含有HAV5’-UTR基因的HAV病毒样颗粒标准物质的方法，包括下列步骤：（1）含有组氨酸标签的VLPs重组质粒pET-NH-MS2his的构建将pET32a质粒使用XbaI和NcoI消化，去除其中的XbaI和NcoI两个酶切位点间的序列，将人工合成的5’-PO4-CTAGATTACAAGGC-3’和5’-PO4-CATGGCCTTGTAAT-3’两条互补的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定；采用一步法扩增试剂盒以MS2Pf1和MS2Pr1为引物，以MS2RNA为模板扩增MS2目的片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的片段，用50μLddH2O洗脱，标记为MS2DNA；采用OneStepRT-PCR，以得到的MS2DNA为模板，分别用引物MS2Pf1和ms2hispr以及ms2hispf和MS2Pr1扩增MS2上和MS2下2个DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后，存于4℃备用；再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pf1和MS2Pr1为引物做PCR，得到引入了编码组氨酸标签序列的MS2DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收后的PCR产物命名为MS2his；分别将制备的pET-NH载体和回收的MS2his片段用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行酶切消化；将双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用胶回收试剂盒回收后与pET-NH载体用SolutionⅠ连接酶进行连接；连接产物转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落作进行酶切鉴定；从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有Amp抗生素的液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时，参照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取；以提取的质粒为模板，以MS2Pf和MS2Pr为引物进行PCR扩增；将PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳检测；若可见载体与1700bp的MS2目的片段即为阳性。（2）构建含有HAV5’UTR的原核表达载体pNH-MS2his按RNA提取试剂盒说明书的方法提取HAV总RNA为模版，以HAV-UTRf1和HA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一组扩增HAV5’‑UTR基因的引物，其特征在于，序列如下：HAV‑UTRf1：ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；HAV‑UTRr1：AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；5‘端和3’端分别加上Hind III和Not I酶切位点。

【技术特征摘要】
1.一组扩增HAV5’-UTR基因的引物，其特征在于，序列如下：
HAV-UTRf1：ATACCTCACCGCCGTTTGCCTAGGCTA；
HAV-UTRr1：AAGAATGAGGAAAAACCTAAATGCC；
5‘端和3’端分别加上HindIII和NotI酶切位点。
2.一种pNH-MS2his重组质粒，其特征在于，pNH-MS2his重组质粒中插入的的HAV5’-
UTR基因片段序列如下：
TCACCGCCGTTTGCCTAGGCTATAGGCTAAATTTTCCCTTCCCTGTCCTTCCCCTATTTCCCCTTGTTTTGTT
TGTAAATATTAATTCCTGCAGGTTCAGGGTTCTTTAATCTGTTTCTCTATAAGAACACTCAATTTTCACGCTTTCTG
TCTTCTTTCTTCCAGGGCTCTCCCCTTGCCCTAGGCTCTGGCCGTTGCGCCCGGCGGGGTCAACTCCATGATTAGCA
TGGAGCTGTAGGAGTCTAAATTGGGGACGCAGATGTTTGGGACGTCGCCTTGCAGTGTTAACTTGGCTCTCATGAAC
CTCTTTGATCTTCCACAAGGGGTAGGCTACGGGTGAAACCTCTTAGGCTAATACTTCTATGAAGAGATGCCTTGGAT
AGGGTAACAGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGACAAAAACCATTCAACGCCGGAGGACTGGCTCTCATCCAGTG
GATGCATTGAGTGAATTGATTGTCAGGGCTGTCTCTAGGTTTAATCTCAGACCTCTCTGTGCTTAGGGCAAACACTA
TTTGGCCTTAAATGGGATCCTGTGAGAGGGGGTCCCTCCATTGACAGCTGGACTGTTCTTTGGGGCCTTATGTGGTG
TTTGCCTCTGAGGTACTCAGGGGCATTTAGGTTTTTCCTCAT。
3.制备含有HAV5’-UTR基因的HAV病毒样颗粒标准物质的方法，其特征在于，包括下列
步骤：
（1）含有组氨酸标签的重组质粒pET-NH-MS2his的构建
将pET32a质粒使用XbaI和NcoI消化，去除其中的XbaI和NcoI两个酶切位点间
的序列，将人工合成的5’-PO4-CTAGATTACAAGGC-3’和5’-PO4-CATGGCCTTGTAAT-3’两条互补
的寡核苷酸复性后插入其中，构建重组质粒pET-NH，测序鉴定；
采用一步法扩增试剂盒以MS2Pf1和MS2Pr1为引物，以MS2RNA为模板扩增MS2目的片
段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收目的片段，用50
μLddH2O洗脱，标记为MS2DNA；
采用OneStepRT-PCR，以得到的MS2DNA为模板，分别用引物MS2Pf1和ms2hispr以及
ms2hispf和MS2Pr1扩增MS2上和MS2下2个DNA片段；扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使
用胶回收试剂盒回收后，存于4℃备用；再以2个片段的混合物为模板，以MS2Pf1和MS2Pr1为
引物做P...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓文，房保海，孙明君，尹伟力，岳志芹，王群，梁成珠，王宫璞，贾俊涛，
申请(专利权)人：山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：山东;37