本发明专利技术涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种以布拉氏酵母菌为表面展示平台表达外源蛋白质的表面展示系统，本系统从布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药品注册证号为s20040038，的DNA组中扩增得到AGA1基因以及AGA2基因，并以pPIC9AGA2质粒为模板扩增AGA2基因表达核,用布拉氏酵母菌的AGA2基因替换上述AGA2基因表达核中的AGA2基因。将获得的AGA1基因和替换后的AGA2基因表达核连接到基础质粒pSP上，分别在超表达启动子TEF1和PGK1控制之下，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。本发明专利技术能够持续表达和Aga2p融合的异源蛋白质并展示在布拉氏酵母菌地表面，从而超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究蛋白与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白表面展示系统，具体提供了一种能够表达展示异源蛋白质的布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)表面展示系统及其构建方法。
技术介绍
布拉氏酵母菌是法国科学家亨利(Henri Boulard)于1920从印尼蒸枝等水果中分离的一种非致病性酵母菌。自1982年Ducluzeau等首次发表布拉氏酵母菌作为益生菌的实验结果以来，对布拉氏酵母菌的抗毒止泻、维持宿主胃肠道微生态平衡、提高机体非特异性免疫力的临床试验和研究越来越多。布拉氏酵母菌现已被公认为最为有价值的益生菌之一，被世界许多国家广泛应用于医学临床和畜牧业生产中。目前，布拉氏酵母菌作为微生态制剂在欧美等广泛用于防治儿童和旅行者的各种腹泻如梭状芽孢杆菌、霍乱弧菌、轮状病毒等感染和抗生素引起的肠炎所致的腹泻。其制剂应用于畜牧业，可有效降低病原菌和有关毒素的浓度，增强非特异性免疫功能，提高生产性能。作为饲料添加剂的应用已得到包括中国、欧盟在内的世界许多国家的认可。随着人们对健康和生态环境的高度重视及在畜禽养殖中的进一步研究，布拉氏酵母菌在医学和畜牧业中必将有更广阔的应用前景。然而，对于布拉氏酵母菌的研究，一直以来主要集中在临床应用方面，而针对布拉氏酵母菌的作用机制，特别是在分子水平上的作用机制，以及对布拉氏酵母菌的遗传改造等却少有研究和报导。究其原因，主要是因为目前尚没有一整套有效的适用于布拉氏酵母菌的分子遗传学技术操作体系。虽然最近的一系列研究表明，布拉氏酵母菌是酿酒酵母的变异株或亚种，然而布拉氏酵母菌也有作一些完全不同于酿酒酵母的生物学、生理学、代谢及遗传学特性，如不能利用半乳糖作为碳源、第9染色体为3倍体、对低pH和温度有较高的耐受性、氮缺乏时可在一定程度上转化成假丝等，特别是布拉氏酵母菌是野生的菌株、双倍体、无营养缺陷型且不能孢子化。因此，适用于酿酒酵母的技术体系和方法无法直接应用于布拉氏酵母菌。这直接限制了对布拉氏酵母菌进行分子生物学、遗传学等方面全面深入的研究，以至于对布拉氏酵母菌从基因水平上进行遗传改的设想，由于缺乏有效的分子遗传学技术操作体系而无法实现。与噬菌体和细菌表面展示相比，酵母菌表面展示系统具有糖基化作用、蛋白翻译后折叠与高等真核动物类似，更利于高效表达具有生物活性的复杂蛋白。此技术已成功应用于筛选特异配体、绘制抗原表位图谱，生产活菌体疫苗、全细胞催化剂，和蛋白的定向进化等。作为益生菌，布拉氏酵母菌的表面展示系统在国内外尚未见任何的研究和报导。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人针对上述现有技术的 情况，提供了一种以布拉氏酵母菌为表面展示平台表达外源蛋白质的表面展示系统，本系统从布拉氏酵母菌，购自法国百科达制药厂，进口药品注册证号为S20040038，的DNA组中扩增得到AGAl基因以及AGA2基因，并以PPIC9AGA2质粒为模板扩增AGA2基因表达核，用布拉氏酵母菌的AGA2基因替换AGA2基因表达核的AGA2基因。将获得的AGAl基因和替换后的AGA2基因表达核连接到基础质粒PSP上，分别在超表达启动子TEFl和PGKl控制之下，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。本专利技术能够持续表达和该通用质粒pSDSb的Aga2p的C端融合的异源蛋白质并展示在布拉氏酵母菌的表面，从而超表达某些异源蛋白，将其作为病原活疫苗载体和研究蛋白与蛋白之间的相互作用具有其它微生物载体不可取代的作用。本专利技术所提供的系统以pSP为基础质粒构建布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒，将AGAl基因的，其基因序列如Seq ID No:8所示，AGA2基因表达核，其基因序列如SeqID No: 10所示，克隆到基础质粒pSP上，由此得到能够在布拉氏酵母菌表面表达的通用表面展示表达质粒pSDSb。异源蛋白与该通用质粒的Aga2p的C端融合从而表面展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。上述的表达质粒pSDSb转化布拉氏酵母菌后，质粒中的Agalp (AGAI基因表达的蛋白)通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p (替换后的AGA2基因表达核表达的蛋白)的N端通过两个二硫键与Agalp连接,异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表达展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。专利技术人的具体方法是将根据引物扩增获得的布拉氏酵母菌AGAl基因，其基因序列如Seq ID No:8所示，和AGA2基因，其基因序列如Seq ID No:9所示，并以该AGA2基因替换AGA2基因表达核的AGA2基因。将获得的AGAl基因和替换后的AGA2基因表达核，其基因序列如Seq ID No: 10所示，克隆到基础质粒pSP上，分别在超表达启动子TEFl和PGKl控制之下，由此得到布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb,质粒中的Agalp (AGAI基因表达的蛋白)通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p (替换后的AGA2基因表达核表达的蛋白)的N端通过两个二硫键与Agalp连接。异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表达展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。本专利技术中将用来鉴定系统可用性的EGFP蛋白与Aga2p的C端融合，进行单克隆筛选鉴定，获得阳性重组质粒，将阳性重组质粒转化到布拉氏酵母菌中，诱导表达蛋白质。 本专利技术使用的EGFP是绿色突光蛋白(Green Fluorescent Protein,简称GFP)增强型变异蛋白。GFP是一种在美国西北海岸所盛产的水母中发现的特殊蛋白质。GFP能在细胞中标定特定融合蛋白的位置及存在，使用GFP进行此类研究，在试验之前不需要进行固定或破坏，能在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用到分子生物学试验的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。而本专利技术所应用的EGFP是GFP的增强型变异蛋白，它的全称是Enhanced Green FluorescentProtein，其荧光比野生型强35倍，具有结构稳定、高效表达、无种系依赖性等特点，更适用于细胞基因表达和蛋白定位检测及细胞示踪标记。本专利技术的具体操作方法是首先根据酿酒酵母中AGAl基因和AGA2基因的序列、AGA2基因表达核序列以及EGFP基因的序列，分别设计合成了基因的一对特异引物，序列分别为AGAl-F :TTGCGGCCGCATGACATTATCTTTCGCTC，其基因序列如 Seq ID No:1 所示；AGAl-R :GGAGATCTTTAACTGAAAATTACAITG，其基因序列如 Seq ID No:2 所示；AGA2-F :TGGATCCATGCAGTTACTTCGCTGTT，其基因序列如 Seq ID No:3 所示；AGA2-R :CCCAAGCTTAAAAACATACTGTGTG，其基因序列如 Seq ID No :4 所示；AGA2-R' :TGTCGACTCAATGGTGATGGTGATGATG,其基因序列如 Seq ID No:5 所示EGFP-F :CCCTCGAGCCATGTCTAAAGGTGAAG，其基因序列如 Seq ID No:6 所示；EGFP-R :TTGGGCCCTTTGTACAAITCATCCATAC，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种布拉氏酵母菌表面展示系统，其特征在于：该系统以pSP为基础质粒,将AGA1基因，其基因序列如Seq?ID?No:8所示，AGA2基因表达核，其基因序列如Seq?ID?No:10所示，克隆到基础质粒pSP上构建布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb，该通用表达质粒含有在布拉氏酵母菌表面表达和表面展示的所有元件，异源蛋白与该通用质粒的Aga2p的C端融合从而表面展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。
【技术特征摘要】
1.一种布拉氏酵母菌表面展不系统，其特征在于该系统以pSP为基础质粒，将AGAl基因，其基因序列如Seq ID No:8所示，AGA2基因表达核，其基因序列如Seq ID No:10所示，克隆到基础质粒PSP上构建布拉氏酵母菌表面展示通用表达质粒pSDSb，该通用表达质粒含有在布拉氏酵母菌表面表达和表面展示的所有元件，异源蛋白与该通用质粒的Aga2p的C端融合从而表面展示在布拉氏酵母菌细胞壁上。2.根据权利要求1所述的展示系统，其特征在于表达质粒pSDSb转化布拉氏酵母菌后，质粒中的Agalp通过GPI锚定在细胞壁上，Aga2p的N端通过两个二硫键与Agalp连接，异源蛋白通过与Aga2p的C端融合从而表...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵孝民，王甜甜，孙慧，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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