本发明专利技术公开一种工业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，包括构建克隆载体pGEMT-gGH、构建酵母表达载体pPICZaA-gGH、获取含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株、自控罐发酵、后处理等步骤，本发明专利技术所述的工业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法可实现石斑鱼生长激素重组基因蛋白的工业化生产，极大降低生产成本，并能获得高产量、稳定的石斑鱼生长激素重组基因蛋白产品，为真正实现在石斑鱼养殖生产中的大规模应用提供实用产品，促进石斑鱼的健康生长。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程发酵领域，具体涉及ー种エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，利用自动控制罐生产石斑鱼生长激素重组蛋白。
技术介绍
生长激素(GH)是鱼体生长发育最重要的内分泌激素，对鱼体的生长、发育起重要调节作用。石斑鱼生长激素(gGH)是脑垂体合成和分泌的ー种分子量在22kD的蛋白多肽，可通过引用基因工程技术，在工程菌中表达鱼类生长激素蛋白，获得大量廉价的生长激 素蛋白产品，通过特殊途径，例如把gGH混合在饲料中，使养殖鱼类从体外直接获取生长激素，由此提高生长速度，降低养殖成本。现有的技术是从斜带石斑鱼中提取生长激素，导入重组表达载体后，转入毕赤酵母中，然后对含有斜带石斑鱼生长激素的重组毕赤酵母，在实验室手工培养发酵，发酵时间长达5天，耗时长、产量低、成本高，无法在实际生产中应用推广。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，利用自动控制罐生产石斑鱼生长激素重组蛋白，极大降低生产成本，并能获得高产量且稳定的石斑鱼生长激素重组基因蛋白(多肽)产品。为实现上述目的本专利技术所采用的技术方案如下 一种エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，包括以下步骤 1)构建克隆载体pGEMT-gGH； 2)构建酵母表达载体pPICZaA-gGH； 3)获取含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株将表达载体pPICZaA-gGH通过电击转化到毕赤酵母细胞X33中，在转化子中选出阳性转化子，然后在阳性转化子中选出多拷贝转化子，检测多拷贝转化子的表型，对多拷贝转化子进行诱导表达，并验证表达产物，获得含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株； 4)自控罐发酵含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株进行摇瓶培养，然后接入50-100L自控罐发酵，加入甲醇作为碳源诱导毕赤酵母，获得石斑鱼生长激素基因重组蛋白；其中发酵条件控制为温度28-30. 5°C, pH5. 5-6. 0，溶氧30_40%，发酵时间80_90h。本专利技术的方法中，发酵条件控制在上述范围之内能获得较高表达量和表达活性的石斑鱼生长激素重组蛋白；5)后处理发酵后的重组蛋白经过冷冻离心分离，之后再经过低温喷雾干燥得到石斑鱼生长激素重组蛋白。上述方法中，构建克隆载体pGEMT-gGH的具体方法为本领域所常用的方法优选的，本专利技术中采用的是在专利申请CN200710183720. 3中公开的构建克隆载体pGEMT-gGH的方法。具体为以已公布的石斑鱼生长激素氨基酸序列为依据，根据酵母表达的密码子的偏好性设计了编码该氨基酸序列的基因片段SEQ ID NO:1，该片段是通过设计寡聚核苷酸SEQID NO:2- SEQ ID NO: 11系列引物以搭桥法PCR的方法合成的重组的石斑鱼生长激素，将重组的石斑鱼生长激素(gGH)与克隆载体连接构建克隆载体pGEMT-gGH。上述方法中，构建酵母表达载体PPICZaA-gGH的具体方法为本领域所常用的方法优选的，本专利技术中采用的是在专利申请CN200710183720. 3中公开的构建酵母表达载体pPICZaA-gGH。具体为以克隆载体pGEMT-gGH为模板，通过PCR扩增重组石斑鱼生长激素基因后，进行酶切和纯化与表达载体PPICZaA的相应酶切位点EcoRI和XhoI进行连接，得到酵母表达载体pPICZaA-gGH。 接种量的多少直接关系到发酵的快慢和成本效益，接种量过少，发酵启动慢，生产耗时长；接种量过大，所需菌种成本高，接种耗时长，易被污染。因此，优选的方案中，本专利技术所述摇瓶培养中发酵培养基的体积为25-30L，接种量为1. 5-1. 8し本发酵生产的目的蛋白需要甲醇作为启动子来诱导表达并提供酵母生长的碳源，如果甲醇用量太高会导致酵母菌死亡，用量过低会因碳源不足而导致酵母菌生长缓慢，甚至停止生长。因此，优选的方案中，所述甲醇的按体积占发酵液体积的0. 55%-0. 7%。上述方法中获得的石斑鱼生长激素基因重组蛋白通过Western Blot和SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳测得其表达量为1. 5-2. Og/L。为了获得更高表达量和表达活性的石斑鱼生长激素重组蛋白，本专利技术优选的方案中，所述发酵条件控制为 温度29. 5-30. 5°C, pH5. 5-6. 0，溶氧30_40%，发酵时间80_90h。本专利技术中，步骤5)冷冻离心分离时的温度为4°C。离心操作为本领域的常规实验操作。本专利技术优选的方案中，所述エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法还包括在发酵过程中检测菌株湿重的步骤在发酵过程中连续三次测取菌种湿重，当菌株湿重在59% 59. 75%之间，并成下降趋势时，终止发酵。因为当菌株的湿重在59% 59. 75%之间时，表明酵母生长稳定性结束，从而判定为菌种停止生长，即达到该次发酵的终止时间。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于本专利技术所述的エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法可实现石斑鱼生长激素重组基因蛋白的エ业化生产，极大降低生产成本，并能获得高产量、稳定的石斑鱼生长激素重组基因蛋白产品，为真正实现在石斑鱼养殖生产中的大規模应用提供实用产品，促进石斑鱼的健康生长。下面结合具体的实施方式对本专利技术作进ー步详细说明。附图说明图1为本专利技术诱导前发酵液温度(°C)与pH 图2为诱导前发酵液溶氧(DO)值(％) 图3为诱导前发酵液菌种湿重(％) 图4为诱导后发酵液温度(°C )和pH图；图5为诱导后发酵液DO值(％) 图6为诱导后发酵液菌种湿重(％) 图7为甲醇诱导表达24h后上清总蛋白Western Blot分析图，M :蛋白分子量标准；N :空载pPICZa A阴性对照；1 :诱导12小时后的上清蛋白；2 :诱导24小时后的上清蛋白； 图8为SDS-PAGE电泳图，I =Marker ;2、3 :空载酵母发酵上清液；4、5 :放罐时的上清液；6、7 :诱导前的发酵上清液。 具体实施例方式一种エ业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，包括以下步骤 1)构建克隆载体pGEMT-gGH； 2)构建酵母表达载体pPICZaA-gGH； 3)获取含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株将表达载体pPICZaA-gGH通过电击转化到毕赤酵母细胞X33中，在转化子中选出阳性转化子，然后在阳性转化子中选出多拷贝转化子，检测多拷贝转化子的表型，对多拷贝转化子进行诱导表达，并验证表达产物，获得含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株； 4)自控罐发酵含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株进行摇瓶培养，然后接入50-100L自控罐发酵，加入甲醇作为碳源诱导毕赤酵母，获得石斑鱼生长激素基因重组蛋白； 5)后处理发酵后的重组蛋白经过冷冻离心分离，之后再经过低温喷雾干燥得到石斑鱼生长激素重组蛋白； 其中发酵条件控制为温度28-30. 50C，pH5. 5-6. 0，溶氧30_40%，发酵时间80_90h ;所述摇瓶培养中发酵培养基的体积为25-30L，接种量为1. 5-1. 8L ;所述甲醇的按体积占发酵液体积的0. 55%-0. 7%。以下是本专利技术优选的实施例。实施例1 按照上述步骤获得石斑鱼生长激素重组蛋白，采用50L的自控罐，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种工业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，包括以下步骤：1）构建克隆载体pGEMT?gGH；2）构建酵母表达载体pPICZaA?gGH；3）获取含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株：将表达载体pPICZaA?gGH通过电击转化到毕赤酵母细胞X33中，在转化子中选出阳性转化子，然后在阳性转化子中选出多拷贝转化子，检测多拷贝转化子的表型，对多拷贝转化子进行诱导表达，并验证表达产物，获得含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株；?4）自控罐发酵：含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株进行摇瓶培养，然后接入50?100L自控罐发酵，加入甲醇作为碳源诱导毕赤酵母，获得石斑鱼生长激素基因重组蛋白；其中发酵条件控制为：温度28?31.5℃，pH5?6.5，溶氧30?40%,?发酵时间80?90h；5）后处理：发酵后的重组蛋白经过冷冻离心分离，之后再经过低温喷雾干燥得到石斑鱼生长激素重组蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种工业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，包括以下步骤 1)构建克隆载体pGEMT-gGH； 2)构建酵母表达载体pPICZaA-gGH； 3)获取含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株将表达载体pPICZaA-gGH通过电击转化到毕赤酵母细胞X33中，在转化子中选出阳性转化子，然后在阳性转化子中选出多拷贝转化子，检测多拷贝转化子的表型，对多拷贝转化子进行诱导表达，并验证表达产物，获得含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株； 4)自控罐发酵含重组石斑鱼生长激素基因的毕赤酵母菌株进行摇瓶培养，然后接入50-100L自控罐发酵，加入甲醇作为碳源诱导毕赤酵母，获得石斑鱼生长激素基因重组蛋白；其中发酵条件控制为温度28-31. 5°C,pH5-6. 5，溶氧30_40%，发酵时间80_90h ； 5)后处理发酵后的重组蛋白经过冷冻离心分离，之后再经过低温喷雾干燥得到石斑鱼生长激素重组蛋白。2.根据权利要求1所述的工业化生产石斑鱼生长激素重组基因蛋白的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：石和荣，张勇，赵会宏，潘忠超，
申请(专利权)人：广东现代农业集团研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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