一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法及其表达载体。本发明专利技术的方法包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人转铁蛋白，其中，该表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和牛生长激素基因终止子，所述启动子是山羊β-酪蛋白基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。本发明专利技术的方法，在动物的乳汁中人转铁蛋白的浓度至少可达到5g/L，比现有的方法提高了160倍以上，具有巨大的商业利用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用
本专利技术属于生物
，特别涉及一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用。
技术介绍
人转铁蛋白(Human transferrin, hTF)是一种非血红素的铁结合糖蛋白，能使得铁离子与之紧密结合，并将其有选择地释放到特定部位与靶细胞上的特异受体结合以行使生理功能[1]，是先天性无转铁蛋白血症等多种疾病治疗必备的药物，同时它还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节[2]。最近几年的研究发现转铁蛋白还是胚胎干细胞和神经干细胞生长非常重要的一种调节因子。目前人转铁蛋白主要从血浆中提取并纯化，不仅步骤繁琐、效率低下，而且原料容易受HIV、HBV等病毒的感染，给制备和使用带来潜在的风险。转基因动物乳腺生物反应器是近些年发展起来的一项生物制药新方法，具有广泛的应用前景。2006年，美国GTC生物制药公司通过转基因动物乳汁生产的重组药物人抗凝血酶III已率先上市，另外尚有多种重组药物蛋白正处于各期临床试验中。因此采用转基因动物乳腺生物反应器来生产诸如人转铁蛋白这样重要的生物蛋白具有很好市场价值。经过二十余年的研究，人们已经在转基因动物乳腺生物反应器研制方面积累了一定的经验。研究发现乳蛋白(即可在乳汁中表达的蛋白)在转基因动物乳汁中的表达水平明显高于非乳蛋白，而这些蛋白由于用量较大，只有当其表达水平超过lg/L时，该转基因动物才有商业利用价值。 但是，到目前为止，根据已有文献报道尚无可在哺乳动物乳汁中高效表达人转铁蛋白的载体，有文献通过兔转铁蛋白基因启动子和增强子指导人转铁蛋白，获得的转基因小鼠乳汁中hTF表达水平亦不超过0.7g/L，尚无法满足乳腺生物反应器的要求。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是针对现有的利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法中人转铁蛋白的表达水平低下的不足，提供一种人转铁蛋白的表达水平达5g/L以上的动物乳腺生产人转铁蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。为此，本专利技术解决上述问题的技术方案之一是:一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其中，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和终止子，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQID N0.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β_酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。本专利技术中，所述的人转铁蛋白基因如常规，较佳的是人转铁蛋白的编码序列，更佳的是序列表中SEQ ID N0.2所示。本专利技术中，所述的终止子是本领域常规。本专利技术中较佳的是牛生长激素基因的终止子,更佳的其序列如SEQ ID N0.3所示。本专利技术中，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体可以是本领域的各种能够转染哺乳动物细胞的表达载体，比如慢病毒载体、腺病毒载体等，较佳的是常规的真核表达载体，优选质粒pcDNA3.1。本专利技术中，所述将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物的方法是常规，较佳的包括将真核表达载体原核显微注射入哺乳动物的受精卵中，然后移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物；或者是慢病毒载体显微注射哺乳动物受精卵的卵周隙，将感染的受精卵移植入假受孕动物中，从而得到转基因动物。本专利技术中所述的哺乳动物是常规，较佳的是小鼠或奶牛，不包括人。本专利技术的技术方案之二是:一种用于制备转基因哺乳动物使其乳腺组织高表达人转铁蛋白的载体，其含有人转铁蛋白基因表达盒，其中，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和终止子，其中所述的启动子是山羊β_酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQID N0.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。该人转铁蛋白基因表达盒的其它优选方式如上所述。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于:本专利技术中采用的山羊β_酪蛋白基因启动子序列同时保留了启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。这些区域含有GRE、STAT等结合位点，这类结合位点是决定乳蛋白表达水平的重要因子。本专利技术通过调整酪蛋白基因启动子中的不同元件，使人转铁蛋白基因(hTF基因)在转基因小鼠中获得了理想的表达水平，平均表达水平达到了 5g/L以上，所述基因的蛋白表达水平提高了至少160倍。乳腺生物反应器产业的特点是成本固定化，即在原料一致的情况下其成本是不变的。所以当提高了乳汁中的蛋白表达量时，提高量获得的将会是药品的净利润。所以业界一般认为只要有50%的蛋白提高，利润就能翻倍。本专利技术使乳汁中人转铁蛋白的表达水平提高了 160倍以上，则利润提高 至少160倍。这是极其高的利润，具有广阔的商业前景。【附图说明】图1为pcDNA3.1-P1A3-TFN表达载体构建线路图。图2为4种不同人转铁蛋白(hTF)表达载体不意图。图3为不同载体在乳腺细胞中表达人转铁蛋白的比较。图4为不同转基因小鼠乳汁中人转铁蛋白的表达水平比较。图5为不同类型人血小板生成素转基因小鼠乳汁中外源蛋白表达水平对比图。【具体实施方式】下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例11、载体构建pcDNA3.1-TFN (pcDNA3.1为购自invitrogen公司的商业化真核表达载体，货号为V795-20)。TFN为克隆的人TF小基因，包括了 hTFcDNA和内含子I，全长约4.1Kb，序列见后)。pcDNA3.1-TFN的构建过程如下:采用长片段PCR扩增山羊基因组DNA，PCR引物序列分别为:5，-AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3，；5，-AGGATCCTTCATGGCTCTC GAT-3，。采用 Apa I+Xho I双酶切通过PCR方法克隆得到的人TF小基因TFN，而pcDNA3.1载体同样采用Apa I+Xho I进行酶切。随后采用连接酶进行连接反应，即得到pcDNA3.1-TFN载体。pcDNA3.1-P1A3 (P1A3为克隆的山羊β酪蛋白基因启动子，参考文献可见“山羊β-酪蛋白基因启动子指导的转基因小鼠乳汁高效表达人凝血因子IX”，序列见后)。pcDNA3.1-Ρ1Α3的构建过程如下:采用长片段PCR扩增山羊基因组DNA，PCR引物序列分别为:5’ -AAGCAGGAATCACAGCATCTAC-3’ ；5’ -AGGATCCTTCATGGCTCTCGAT-3’，得到的山羊 β -酪蛋白基因启动子(命名为Ρ1Α3)，用Apa I和BamH I进行酶切，而pcDNA3.1载体同样采用这两种酶进行酶切。随后采用连接酶进行连接反应，并将连接产物进行感受态细胞转化、挑取阳性克隆，即得到pcDNA3.1-P1A3载体。限制本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其特征在于，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和pcDNA3.1载体中携带的牛生长激素基因终止子，其中所述的启动子是山羊β‑酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQ IDNO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β‑酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子，所述的人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的终止子的序列为牛生长激素基因终止子，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。

【技术特征摘要】
1.一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其特征在于，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和PCDNA3.1载体中携带的牛生长激素基因终止子，其中所述的启动子是山羊酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQIDN0.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子，所述的人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID Ν0.2所示，所述的终止子的序列为牛生长激素基因终止子，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾凡一，颜景斌，曾溢滔，
申请(专利权)人：上海滔滔转基因工程股份有限公司，上海市儿童医院，
类型：发明
国别省市：上海;31