一种在解脂耶罗维亚酵母中制备多肽的方法技术

本发明专利技术涉及一种在hp4d启动子调节下在解脂耶罗维亚酵母中制备蛋白质、优选外源蛋白质的方法。具体而言，本发明专利技术描述了一种通过调节碳的供应和/或氮的供应而调节解脂耶罗维亚酵母的生长速率的方法。发现生长速率小于0.045h″l对于增加解脂耶罗维亚酵母生物质和增加所生产的感兴趣的外源蛋白质的量而言是最优的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】—种在解脂耶罗维亚酵母中制备多肽的方法
技术介绍
本专利技术涉及一种在解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia Iipolytica)中制备多肽的方法。特别地，本专利技术涉及一种通过操控酵母的生长条件并由此操控所述酵母的生长过程，对使用hp4d启动子在解脂耶罗维亚酵母(Y. Iipolytica)中表达感兴趣的多肽进行优化的方法。解脂耶罗维亚酵母是一种用于生产柠檬酸的非常规酵母，其已被美国食品和药物管理局(American Food and Drug Administration, FDA)确定为公认安全(GRAS)状态(Fickers et al.，2005)。许多分子工具均可用于外源蛋白质在解脂耶罗维亚酵母中的表达，因为该酵母具有高的分泌能力。多拷贝带载体(Multi-copy vector)含有ura3d4标记，其在多拷贝互补中是需要的，以允许对带多个插入的转化株进行筛选(Madzak et al. , 2004)。所述ura3d4筛选标记确保对带10 - 13个完整表达盒(integrated cassette)拷贝的转化株的筛选(Juretzek et al.，2001)。所述hp4d启动子是用于在解脂耶罗维亚酵母中表达外源多肽的最常用的启动子(Madzak et al.，2004)。该启动子由XPR2启动子的上游激活序列I的四个串联重复拷贝组成，并且其表达不受环境条件的显著影响。但是，其调节作用是未知的，并且据报道其对蛋白质的生产是半组成型(quasi constitutive)的,且调节作用仅发生在早期生长稳定期中。因此需要对hp4d启动子获得更多的理解，以确定该启动子是否可用于操控并最终增加蛋白质在宿主细胞中的表达。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了一种在解脂耶罗维亚酵母中表达多肽的方法，该方法包括步骤使解脂耶罗维亚酵母发酵，该酵母已经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽；和在发酵期间将解脂耶罗维亚酵母的生长速率限制为低于0. 0451!'所述生长速率可以限制为约Ο. ^βΙΓ1至约O.CMOh—1，更优选约Ο. ^δΙΓ1至约0. 0391^。甚至更优选，所述生长速率可以限制为约0. 0351!'所述生长速率可以通过控制加入至含解脂耶罗维亚酵母的发酵溶液中的食物源(例如碳源和/或氮源)的量进行限制。所述碳源可为葡萄糖，所述氮源可为酵母提取物。所述多肽可为蛋白质，例如酶，如脂肪酶或甘露聚糖酶。所述发酵可为分批发酵法、分批进料发酵法、反复分批进料发酵法或连续发酵法。优选地，所述方法增加了多肽产量，相比于生长速率不受限制的对照组解脂耶罗维亚酵母。在本专利技术的另一个实施方案中，提供了一种在上述方法中使用的转化了多核苷酸的解脂耶罗维亚酵母，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽。在本专利技术的又一个实施方案中，提供了一种含有用于实施上述方法的解脂耶罗维亚酵母的试剂盒(kit)。附图说明图I :显示了葡萄糖峰值对稳定解脂耶罗维亚酵母Polf 413-5发酵的p02、残余葡萄糖和生物质浓度的影响。图2 :显示了稀释速率对在稳定连续发酵中的解脂耶罗维亚酵母Polf413_5的生物质、残余葡萄糖和酶体积活性(volumetric enzyme activity)的影响。图3 :显示了稀释速率对在稳定连续发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Polf413_5生产脂肪酶的响应程度的影响。生长速率如数据记录单中所给出的。 图4 :显示了稀释速率对在稳定连续发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Polf413_5生产脂肪酶的体积速率和比速率的影响。图5 :显示了在二次分批发酵中的解脂耶罗维亚酵母Polf 413-5的生长情况。图6 :显示了在二次分批发酵中通过解脂耶罗维亚酵母Polf 413-5生产脂肪酶。图7 :显不了指数全培养基进料(exponential full medium feed)对解脂耶罗维亚酵母Polf413-5的生长的影响。全培养基以O. 0291Γ1 (开符)和O. 0411Γ1 (闭符)的指数进料速率进料。图8 :显示了指数全培养基进料对通过解脂耶罗维亚酵母Polf 413-5生产脂肪酶的影响。全培养基以O. 0291Γ1 (开符)和O. 0411Γ1 (闭符)的指数进料速率进料。图9 :显示了指数全培养基进料对通过解脂耶罗维亚酵母Polf 413-5对生产脂肪酶的速率影响。全培养基以O. 0291Γ1 (开符)和O. 0411Γ1 (闭符)的指数进料速率进料。图10 :显示了在二次分批发酵中Y. Iipolytica ManA:HmA(Roth等，2009)的生长情况。图11 :显不了指数全培养基进料对Y. Iipolytica ManA:HmA的生长的影响。全培养基以O. 0351Γ1 (开符)和O. 045h^ (闭符)的指数进料速率进料。图12 :显示了指数全培养基进料对通过Y lipolytica ManA:HmA生产甘露聚糖酶的影响。全培养基以O. 0351Γ1 (开符)和O. 045h^ (闭符)的指数进料速率进料。图13 :显示了指数全培养基进料对通过Y lipolytica ManA:HmA生产甘露聚糖酶的速率的影响。全培养基以O. 0351Γ1 (开符)和O. 045h^ (闭符)的指数进料速率进料。具体实施例方式现将在下文参照附图对本专利技术进行更充分描述，其中仅说明了本专利技术的几个但不是所有的实施方案。本专利技术公开了一种在解脂耶罗维亚酵母中表达多肽的方法，其中使解脂耶罗维亚酵母发酵，所述酵母经多核苷酸转化，所述多核苷酸在hp4d启动子的控制下编码多肽，并在发酵期间限制解脂耶罗维亚酵母的生长速率低于O. 045h-1o所述生长速率可限制为约O. 023h^至约O. (MOtT1，更优选约O. 035^'至约O. 0391Γ1。例如，所述生长速率可限制为约 O. 023,0. 024,0. 027,0. 029,0. 035 或 O. 0391Γ1。所述生长速率可通过控制加入至发酵溶液中的碳源、氮源和/或其他源例如葡萄糖或酵母提取物的量进行限制。所述发酵可为分批发酵法、分批进料发酵法或连续发酵法。所述多肽可为外源或同源的多肽、蛋白质或酶。在下述实施例中，使用脂肪酶和甘露聚糖酶作为通过解脂耶罗维亚酵母表达的示例酶。在半组成型的hp4d启动子的调节下通过解脂耶罗维亚酵母进行的酶的生产始于生长稳定期开始时。使用在葡萄糖受限制条件下的连续发酵来确定生长速率对在hp4d启动子调节下生产的脂肪酶的影响。Lip2基因，其在解脂耶罗维亚酵母中编码细胞外的脂肪酶和来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatu)的内切-I, 4_β-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶)在半组成型的hp4d启动子调节下用多拷贝LIP2表达框在Y lipolytica Polf中进行过表达(MatA，Leu2·-207, ura3-302, xpr2-322, axp-2)。生产的最大脂肪酶体积活性13014nkat. ml—1是在生长速率为O. 024h^时，该速率为估算的最低生长速率。但是，脂肪酶生产的最大速率在生长速率大于O. 0351^时得到。脂肪酶生产的临界生长速率在O. 0351Γ1和O. 0391Γ1之间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：彼得勒斯·雅各布斯·范泽尔，
申请(专利权)人：CSIR公司，
类型：
国别省市：