本发明专利技术提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法，通过构建含有经过酵母偏爱密码子优化编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，并转化毕赤酵母，获得的重组毕赤酵母经过发酵培养，分泌产生抗菌肽NZ2114。本发明专利技术通过优化抗菌肽NZ2114基因序列，构建特异表达载体，首次实现了抗菌肽NZ2114在毕赤酵母中的高效表达，产量突破克级水平，克服了大规模生产中产量过低或化学合成成本过高的问题，并建立完善的纯化体系，可实现规模化生产，可应用于抗菌药物开发，饲料添加剂开发等领域，具有广阔的应用价值和市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。
技术介绍
抗菌肽(AMP)是生物体内具有生物活性的小分子多肽，主要特点如下抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，而且对真菌，原虫乃至病毒和肿瘤细胞都有杀伤或抑制作用(Brandenburg, Merres et al. 2012)。由于其突出的生物学特性,最有潜力作为型新安全无害抗生素替代品，从而备受科学界关注(Eckert 2011; Brandenburg, Merres等,2012)。Plectasin是2005年由Mygid等人从来源于北欧松林地表腐生子囊菌(Pseudoplectania nigrella)中分离得到一种具有抗菌功能的抗菌肽,也是首例真菌防御素。Plectasin基因开放阅读框编码一个95个残基长的前体肽，由一个信号肽序列(残基1-23)，一个前片断(残基23-55)和一个40个残基的C端区域的成熟多肽(残基56-95)，与几种无脊椎动物防御素存在50-55%序列相似性。Plectasin成熟多肽由40个AA组成，含有6个Cys残基和5个Iys残基，一个区别的四肽(DEDD)模式，分子量为4，398. 80Da，净电荷在+ I到+ 3之间变化，主要取决于它的两个组氨酸的离子状态。其6个Cys在分子内形成3对二硫键(Cys4_Cys30，Cysl5-Cys37, Cysl9_Cys39)，二级结构由三对二硫键稳定的一个N端的a-螺旋和C端的两个反向平行的￠-折叠结构以及螺旋和折叠结构之间的Loop 区组成(Mygind, Fischer 等，2005)。NZ2114是新型的抗菌肽,属`于真菌防御素Plectasin的突变体。D. Ravent6s等(2005)基于提高该真菌防御素对耐药金黄色葡萄球菌的抗菌活性，通过高通量突变筛选到一个对金黄色葡萄球菌具有强烈抑菌活性的突变体(Raventos，Taboureau等，2005)。Brinch(2010)等对NZ2114胞内和胞外杀菌活性做了综合研究，结果显示，NZ2114对MRSA、VRSA、MSSA具有较强的胞内和胞外杀菌活性，与达托霉素相当，而胞内杀菌活性甚至优于万古霉素(Brinch, Tulkens等,2010)。D. Andes等(2009)对14株金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA和耐青霉素的肺炎链球菌FRSP)，结果显示NZ2114的MIC相对于本体防御素增加30倍之多(0. 06 u g/ml 2. 0 u g/ml) (Andes, Craig等，2009)，进而通过小鼠感染模型对其药物动力学进行相关研究，结果显示，皮下注射30min后小鼠血液中NZ2114浓度达到峰值，其药物半衰期为0. 38到1. 0h，同时对NZ2114的蛋白结合率进行了检测，结果表明NZ2114蛋白结合率为80%(Andes，Craig等，2009)。D.Andes等(2009)还对NZ2114抗生素后效应(PAE)参数进行研究，其对感染肺炎链球菌(S. pneumoniae strain ATCC 10813, MIC, 0. 06mg/ml))小鼠注射单剂量为 10、40 和 60mg/kg 后其 PAE 分别为 2. 3,4. 5,7. 7h,而 NZ2114 对金黄色葡萄球菌(S. aureus strain ATCC25923，MIC,1. 0mg/ml)的PAE分别为1. 2、2. 6、4. 6h。而且相关研究表明，NZ2114以高于MIC单剂量处理的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌在12 15h内停止用药，病原菌不会出现反弹。金黄色葡萄球菌是世界范围内流行的易感病原菌，容易引起人败血症，表皮及软组织感染，肺炎等疾病(Diekema, Pfaller等,2001)。随着人类抗生素大量频繁使用，加上金黄色葡萄球菌自身易获得耐药性，大量MRSA菌株不断在临床或社区发现，以致形成了两大类型医院获得型 MRSA (HA-MRSA)和社区感染型 MRSA (CA-MRSA) (Rountree and Freeman1955;Chambers and DeLeo 2009;Elston, Meigh 等，2009;Skov and Jensen 2009;Eckert2011)，对人类健康造成巨大威胁。研究开发新型杀灭金黄色葡萄球菌的抗生素替代品对于预防和治疗由金黄色葡萄球菌，特别是MRSA引起中疾病具有重要意义。抗菌肽替代传统抗生素应用于由细菌感染所引起的各种疾病一直备受科学界关注，也是人类对抗各种病原菌的有效武器。抗菌肽抗菌谱过宽，稳定性不好，具有细胞毒性，抗菌活性不足，用药多样性，生产成本高(基因克隆表达产量太低和化学合成成本过高)等一直是抗菌肽应用中面临的挑战(Eckert 2011)。抗菌肽NZ2114具有抗菌谱窄，不具有细胞毒性，抗菌活性强等优点。目前，关于抗菌肽NZ2114相关研究中使用的NZ2114均为化学合成(Andes, Craig 等，2009; Brinch, Tulkens 等，2010; Xiong, Hady 等，2011),且未见有关其基因克隆表达方面的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在重组毕赤酵母中高效表达抗菌肽NZ2114的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，包括诱导型启动子、位 于启动子下游的编码a-因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。已知抗菌肽NZ2114 (菌丝霉素衍生物)的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。前述的表达载体，其中所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列是按照酵母所偏爱的密码子进行优化的序列，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。前述的表达载体，出发载体优选为pPICZ a A。前述的表达载体，在编码a -因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG ;在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。本专利技术还提供含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞优选为毕赤酵母，更优选为毕赤酵母X-33基因工程菌。本专利技术还提供一种重组巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X_33/NZ2114,现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年12月13日，保藏号CGMCC No. 6987。本专利技术还提供培养上述毕赤酵母X-33基因工程菌的方法，包括以下步骤I)种子液的制备从YPD平板挑取酵母转化子单菌落，接种于含IOOii g/mlzeocin的IOml YH)液体培养基中，29 °C，250rmp，摇床培养18_24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培养基中，29°C，250rmp，摇床培养16_18h，至OD6tltol值为6，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，其特征在于，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α?因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽NZ2114的DNA序列，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。
【技术特征摘要】
1.一种含有编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的表达载体，其特征在于，包括诱导型启动子、位于启动子下游的编码α -因子分泌信号肽的核苷酸序列以及编码抗菌肽ΝΖ2114的 DNA序列，所述编码抗菌肽ΝΖ2114的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述编码抗菌肽NZ2114的DNA序列如 SEQ ID No. 2 所示。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体的出发载体为 pPICZa A04.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，在编码a-因子分泌信号肽的核苷酸序列的5’端连接有XhoI酶切位点，且在XhoI酶切位点的5’端连接有保护碱基CCG ;在编码抗菌肽NZ2114的DNA序列的3’端连接有XhaI酶切位点，且在XhaI酶切位点的3’端连接有保护碱基GC。5.含有权利要求1-4任一项所述表达载体的宿主细胞。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其为毕赤酵母。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其为毕赤酵母X-33基因工程菌。8.权利要求7所述基因工程菌的培养方法，包括以下步骤1)种子液的制备从YPD平板挑取酵母转化子单菌落,接种于含100yg/mlzeocin的 IOml YPD液体培养基中，290C，250rmp，摇床培养18_24h，以1%接种量接种于200ml YPD液体培...
【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，张勇，滕达，王秀敏，毛若雨，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：
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