本发明专利技术“植物根部特异表达Bt-cry6A晶体蛋白在根结线虫防治中的应用”涉及植物转基因技术，本发明专利技术提供用于在植物的根中特异表达Bt-cry6A基因的重组表达载体pBP-bt06，以及将该表达载体转化番茄的转基因方法。本发明专利技术合成的基因是对密码子进行优化的。将优化后的编码Bt-Cry6A晶体蛋白的人工基因转入番茄品种。实验结果表明，本发明专利技术成功获得了在根部特异表达Bt-cry6A基因的转基因番茄。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病虫防治
，特别是涉及一种由根部特异启动子DNA-^ promoter驱动的Bt_cry6A基因植物表达载体及其在根结线虫防治和研究中的应用。
技术介绍
根结线虫是农业生产上危害最为严重的植物寄生线虫之一，其适应性强、传播途径多样、寄主范围包括单子叶与双子叶草本或木本植物等2000多种植物。近年来，随着对线虫侵染方式，植物自身抗病防御体系研究的不断深入，以及分子生物学理论和生物工程技术的不断发展，抗线虫基因的分子遗传操作技术已趋向成熟，为利用植物自身防御体系及线虫自身生理生化特点，通过基因工程手段，建立一个具有高效、经济、环保的线虫综合控防策略成为可能(Atkinson HJ, Urwin PE, McPherson MJ. Engineering plantsfor nematode resistance. Annual Review of Phytopathology,2003. 41 (I):615-639.；Williamson VMj Hussey RS. Nematode pathogenesis and resistance in plants.Plant Cell，1996,8 :1735-1745 ;Williamson VM. Plant nematode resistance genes.Current Opinion in Plant Biology，1999，2:327-331 ;Wi11iamson VMj GleasonCA. Plant-nematode interactions.Current Opinion in Plant Biology，2003，6 :327-333)。 在过去的植物基因工程研究中，人们常使用组成型启动子表达外源基因，在这类启动子的控制下，外源基因在转基因植物所有的细胞以及整个发育阶段都表达。然而外源基因在受体植物体内持续、高效地表达，可能会改变植物的某些性状，从而对植物生长发育产生不利影响，严重地会导致植株死亡；另外，这种持续的组成型表达，从植物能量消耗角度来讲也是一种浪费，还可能带来食品安全性问题。严格地讲，组织特异性的启动子更适用于生产外源蛋白，因为这些蛋白可以集中表达在植物的某些部位从而更便于产物的加收。此外，根是植物生长发育的重要器官，也是根结线虫侵染植物的主要途径，研究根特异性启动子对根结线虫的防治具有重要意义。所以从植物生长发育和经济有效的角度以及抗病性的研究方面考虑，根组织特异性启动子也具有研究和应用价值。关翠平分离鉴定TYLCCNVY10分子上DNAP Cl基因启动子(GeneBank登录号A3J19675)，组织化学检测表明，该启动子能够驱动gus基因在转基因植株的根部及韧皮部细胞特异性表达，是花椰菜花叶病毒(CMV) 355 启动子活性的 10 16% (Cuiping Guan, Xueping Zhou, Phloemspecific promoter from a satellite associated with a DNAvirus， Virus Research115(2006) 150-157)。产芽孢的苏芸金杆菌是一种能够杀死昆虫的土壤微生物，这种微生物分泌两种蛋白，一种是外毒素，另一种是内毒素。外毒素是由vip3a基因编码，在营养生长期从菌体中分泌出来，研究表明P -外毒素对线虫有效(Devidas and Rehberger, 1992)(Devidas P. and Rehberger L.A. The effects of exotoxin (Thuringiensin) fromBacillus thuringiensis on Meloidogyne incognita and Caenorhabditis elegans.Plant and Soil. 1992，145 (I) : 115-120.)。第二类毒素为 S -内毒素，是由 cry 基因族编码，在孢子产生时以包涵体的形式产生的。cry5B编码的蛋白对秀丽线虫具有毒性，且线虫的中肠受到了破坏，对于雄虫、二龄幼虫和不育的突变体具有致命的效果；秀丽线虫的突变体对cry5B产生了抗性，对cry6A敏感，这一点表明线虫与蛋白的结合区域具有一定的特异性(Marroquin L. D. , Elyassnia D. , Griffitts J. S. , FeitelsonJ.S.and Aroian R. V. Bacillus thuringiensis(Bt) toxin susceptibility andisolation of resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans.Genetics. 2000, 155 (4) : 1693-1699)。Marroquin研究表明了这种蛋白在根中的表达对线虫具有有效的防治作用(Marroquin L. D. , Elyassnia D. , Griffitts J. S. , FeitelsonJ.S. and Aroian R. V. Bacillus thuringiensis(Bt) toxin susceptibility and isolationof resistance mutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 2000, 155:1693-1699)。目前，利用Bt防治植物寄生线虫的研究很少，尤其是在根部表达Bt杀虫基因，迄今没有这方面的报道。
技术实现思路
本专利技术根据上述领域存在的空白和根结线虫防治的需要，提供一种由根部特异启动子DNAP驱动Bt-cry6A基因超表达的植物表达载体及该载体用于防治根结线虫的方法。用于在植物根部特异表达Bt_cry6`A基因的重组表达载体pBP_bt06，骨架载体为pBI121,启动子为DNA 0 promotor,外源基因为序列为SEQ ID No. 4所示的优化Bt_cry6A基因。转入有上述重组表达载体的菌株。所述菌株指转入有pBP_bt06的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。一种研究苏云芽孢杆菌基因功能的新方法，其特征在于，将上述重组表达载体转化到根癌农杆菌中，然后转化植物，通过观察转基因植株，确定此基因对根结线虫的防治效果。一种获得抗根结线虫的转基因植物的方法，包括如下步骤(I)构建含有苏云金芽孢杆菌的Bt_cry6A基因的根部特异性重组表达载体，(2)将重组表达载体转入到宿主植物中，筛选能够表达Bt_cry6A蛋白的阳性转化子。所述重组载体是pBP_bt06。所述将重组表达载体转入到番茄中，筛选能够表达Bt-Cry6A蛋白的阳性转化子，包括如下步骤(I)准备植物转化外植体，(2)制备农杆菌转化液，(3)农杆菌转化液侵染外植体，然后共培养，(4)对共培养的外植体进行选择培养以分化愈伤组织，(5)生根培养分化的愈伤组织获得转基因植株。所述准备植物转化外植体包括外植体预培养，指将取自番茄幼苗的外植体放置在MS+50 u g本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于在植物根部特异表达Bt?cry6A基因的重组表达载体pBP?bt06，骨架载体为pBI121，启动子为DNAβpromotor，外源基因为序列为SEQ?ID?No.4所示的优化Bt?cry6A基因。
【技术特征摘要】
2011.11.18 CN 201110369811.51.用于在植物根部特异表达Bt-cry6A基因的重组表达载体pBP_bt06，骨架载体为pBI121,启动子为DNA β promotor,外源基因为序列为SEQ ID No. 4所示的优化Bt_cry6A基因。2.转入有权利要求1所述重组表达载体的菌株。3.根据权利要求1所述的菌株，指转入有pBP-bt06的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) EHA 105。4.一种研究苏云芽孢杆菌基因功能的新方法，其特征在于，将权利要求1所述的重组表达载体转化到根癌农杆菌中，然后转化植物，通过观察转基因植株，确定此基因对根结线虫的防治效果。5.一种获得抗根结线虫的转基因植物的方法，包括如下步骤 (I)构建含有苏云金芽孢杆菌的Bt-cry6A基因的根部特异性重组表达载体， (2 )将重组表达载体转入到宿主植物中，筛选能够表达Bt-cry6A蛋白的阳性转化子， 所述重组载体是pBP-bt06。6.根据权利要求5所述的方法，所述将重组表达载体转入到番茄中，筛选能够表达Bt-06蛋白的阳性转化子，包括如下步骤 (1)准...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国华，梅眉，王殿东，田雪亮，茆振川，杨宇红，谢丙炎，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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