蛋白质晶体在低pH下的再增溶制造技术

本发明专利技术披露了一种用于纯化发酵过程中制备的蛋白质产物的方法，其中感兴趣的蛋白质以固体、结晶或非晶形形式存在于发酵容器中，其中发酵液的pH被调节至低pH从而使感兴趣的蛋白质溶解并可以从不溶物中有效地分离出。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表的引用本申请包括计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。专利
本专利技术涉及蛋白质纯化领域，具体涉及通过发酵过程制备的蛋白质的蛋白质纯化领域。专利技术背景工业蛋白生产的一个重要部分是将所希望的蛋白质从其中已经生成了蛋白质的产物混合物的其余部分中进行纯化。在发酵工业中，蛋白质一般通过经设计或选择以产生大量所希望的蛋白质的特殊细胞产生。所生产的蛋白质可以被这些细胞分泌到细胞周围的体液中。已经在发酵期间产生蛋白质之后，一般在蛋白质处于预期形式和纯度之前在后续步骤中对其进行纯化。在纯化过程期间，通常将所产生的蛋白质从生产培养基的一种或多种组分中分离，并且通常涉及可溶性蛋白质从固体细胞物质中的分离。如果蛋白质以足够高的量生产，那么其可以以结晶形式沉淀，这为通常发酵之后的纯化过程中造成了额外的挑战，因为蛋白质需要是可溶的以便从产物混合物的固体细胞物质和/或其他固体组分中分离。在这种情况下，可以用另外的水或能溶解已沉淀的蛋白质的其它流体稀释产物混合物。然而，即使稀释该产物混合物可以解决在产物混合物中沉淀的蛋白质的问题，但这是一个不太希望的解决方案，因为这也意味着体积增大，并且因此随后的纯化设备必须能够处理由于稀释产生的更大的体积，这通常意味着更多的投资和更高的操作花费是必需的，以应对增加的体积。因此，需要一种使用于分离过程的蛋白质产物再增溶的方法，其中再增溶发生而不引发体积的高度增加。专利技术既述在第一方面，本专利技术涉及用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2-6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：a.提供发酵液，b.任选地将pH调节至低于组氨酸侧链的pKa的值；c.任选地保持该混合物一段时间；并且d.从来自发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。在第二方面，本专利技术涉及一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至一种或多种指导该感兴趣的蛋白的生产的控制序列上，和至少一种编码修饰蛋白的多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至一种或多种指导该修饰蛋白的生产的控制序列上。在第三方面，本专利技术涉及一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至一种或多种指导该感兴趣的蛋白的生产的控制序列上，和至少一种编码修饰蛋白的多核苷酸，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白被修饰为包含位于蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基，经修饰的基因可操作地连接至一种或多种指导该修饰蛋白的生产的控制序列上。在另一方面，本专利技术涉及使用第二方面的重组微生物以产生蛋白产品，该蛋白产品包含感兴趣的蛋白和修饰蛋白，与该感兴趣的蛋白相比该修饰蛋白具有携带沿C-末端和/或N-末端延伸的2-6个组氨酸残基的相同氨基酸序列。优选地，该感兴趣的蛋白是一种酶。附图简要说明图1A示出了SDS-page凝胶，该SDS-page凝胶显示来自溶菌酶发酵与发酵期间所取样本的上清液。图中的泳道1是标记物，泳道2-6分别为97小时后、120小时后、144小时后、169小时后以及192小时后来自溶菌酶发酵的发酵液的上清液样品；并且泳道7是纯化的溶菌酶标准。可以看出，由于沉淀，与144小时后相比在169小时后和192小时后溶菌酶的量降低。图1B示出了SDS-page凝胶，该SDS-page凝胶显示来自溶菌酶发酵与发酵期间所取样本的上清液。图中的泳道1是标记物，泳道2-6分别为97小时后、120小时后、144小时后、169小时后以及192小时后来自溶菌酶发酵的发酵液的上清液样品；并且泳道7是纯化的溶菌酶标准。可以看出，在整个发酵过程期间溶菌酶的量增加。专利技术详述定义编码序列：术语“编码序列”是指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本专利技术的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本专利技术的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)下述任何物质，包括但不限于任何酶、变异核酸、蛋白质、肽或辅因子，其中所述物质至少部分地从在自然界中与该物质结合的一种或多种或所有天然存在的组分移除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指呈其在翻译以及任何翻译后修饰之后的最终形式的多肽，所述修饰如N末端加工、C末端截断、糖基化、磷酸化等。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C末端和/或N末端氨基酸)。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码成熟多肽的多核苷酸。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。序列一致性：用参数“序列一致性”来描述两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。出于本专利技术的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2‑6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：a.提供发酵液，b.任选的调节pH至低于6.0的值；c.任选地保持该混合物一段时间；并且d.从来自该发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.28 EP 14162436.11.一种用于纯化如下过程中蛋白质产物的方法，其中该蛋白质的至少一部分具有位于该蛋白质表面上的2-6个组氨酸残基；该过程包括以下步骤：a.提供发酵液，b.任选的调节pH至低于6.0的值；c.任选地保持该混合物一段时间；并且d.从来自该发酵液的至少一部分固体物质中分离溶解的蛋白质产物。2.如权利要求1所述的方法，其中位于该蛋白质的表面上的2-6个组氨酸位于一级序列的内部，或其中位于该蛋白质的表面上的2-6个组氨酸处于该蛋白质的C-末端和/或N-末端延伸的形式。3.如权利要求2所述的方法，其中在感兴趣的蛋白质的表面上的2-6个组氨酸残基中的至少一个通过取代或插入被提供。4.如权利要求1-3所述的方法，其中该蛋白质产物是选自水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶、或转移酶中的一种酶；如α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、溶菌酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。5.如权利要求4所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:25具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性的蛋白酶。6.如权利要求4所述的方法，其中该酶是与SEQ ID NO:18具有至少80％序列一致性，优选地至少90％序列一致性，优选地至少95％序列一致性，优选地至少96％序列一致性，优选地至少97％序列一致性，优选地至少98％序列一致性，优选地至少99％序列一致性的溶菌酶。7.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中感兴趣的蛋白质在pH 4.5下的溶解度高于pH 7.0下的溶解度至少10％，优选地高于至少20％，优选地高于至少30％，优选地高于至少40％，优选地高于至少50％，优选地高于至少60％，优选地高于至少70％，优选地高于至少80％，优选地高于至少90％，优选地高于至少100％。8.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中发酵液中的蛋白质产物的浓度是至少3g/l，如至少4g/l，如至少5g/l，如至少6g/l；如至少7g/l，如至少8g/l，如至少9g/l；如至少10g/l，如至少11g/l，如至少12g/l；如至少13g/l，如至少14g/l，如至少15g/l；如至少16g/l，如至少17g/l，如至少18g/l；如至少19g/l，如至少20g/l。9.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中步骤b)中的pH被调节至低于6.0，优选地低于5.5，优选地低于5.0，优选地低于4.5的pH值。10.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。11.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中通过在生长培养基中培养微生物来提供该发酵液。12.如权利要求11所述的方法，其中该微生物选自属于芽孢杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，或选自属于曲霉属、木霉属、青霉属、镰孢属的真菌，如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、酱油曲霉、里氏木霉、长枝木霉或绿色木霉；或优选地选自属于酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属、汉森酵母属(Hanensula)、克鲁维酵母(Klyveromyces)属的酵母；如酿酒酵母、葡萄汁酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母。13.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中使用过滤、离心或倾析进行步骤d中的分离。14.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在步骤d中的分离之前的预处理步骤，如稀释、添加盐以及添加聚合物。15.如前述权利要求中的任一项所述的方法，其中该蛋白产物包含具有给出的氨基酸序列的感兴趣的蛋白质和除了2-6个组氨酸残基的C-末端和/或N-末端延伸外具有相同氨基酸序列的修饰的蛋白质。16.如前述权利要求中的任一项所述的方法，该方法包括步骤c中的保持时间段，并且其中该保持时间段在10秒至90分钟的范围内，优选地在1分钟至90分钟的范围内，优选地在1分钟至60分钟的范围内，优选地在1分钟至30分钟的范围内，如在5分钟至30分钟的范围内，并且最优选地在10分钟至20分钟的范围内。17.一种重组微生物，其包含编码感兴趣的蛋白的至少一种多核苷酸，该至少一种多核苷酸可操作地连接至指导该感兴趣的蛋白的生产的一个或多个控制序列上；和编码修饰蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·E·彼泽森，J·M·佩尔松，E·P·弗里斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK