本发明专利技术公开了草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法，通过样品RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应不超过2.5h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是RT-PCR检测的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可现场实时检测，因此本发明专利技术是一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及草莓潜隐环斑病毒的检测技术，具体涉及草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法。
技术介绍
草莓潜隐环斑病毒virus,SLRSV)隶属于紅豆花叶病毒科线虫传多面体病毒属[1]，是蔷薇科果实类作物上的重要病害之一，也是国家质检总局发布的重要检疫性有害生物。SLRSV能侵染种子、种球、块茎和苗木等，病毒侵染植株后，主要表现为叶片褪绿、畸形、植株矮化、产量下降以及品质下降等现象，严重时可引起毁灭性灾害。目前SLRSV的检测方法主要有指示植物小叶嫁接法、血清学检测和分子生物学检测等。SLRSV的症状表现比较复杂，同种病毒在不同的指示植物上，症状变化比较大，而上述方法对于病毒种类的鉴定检测耗时长，灵敏度较低。环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)作为一种新颖的核酸扩增方法，同样具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点；该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的Bst DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高；同时，LAMP识别靶序列上的6 8个特异性位点，其特异性也很强；LAMP只在60°C 65°C进行恒温扩增，只要水浴锅即可，无需特殊的仪器，操作非常简单；而且LAMP的整个检测反应只需I h 2.5 h，检测周期非常短。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为:草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其步骤如下: a、总RNA提取:检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行； b、RT-LAMP扩增:20μ L的RT-LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液10 μ L，浓度5 U/μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，浓度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，样品总RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量为ddH20，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2μΜ，引物Loopl和Loop2的终浓度各为0.8 μ M，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列为gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列为acagcaaaca gagaaccact acc,引物Loopl的核苷酸序列为gcaaagcccatttccacagt,引物Loop2的核苷酸序列为ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列为 cgataggcat cgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列为tactttggtt cgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a,反应条件为 60 65°C 的恒温水浴锅中扩增I 1.5 h，得到扩增产物； C、在扩增产物中加入0.1 μ L的荧光染料SYBR green I，若呈绿色则样品中感染有草莓潜隐环斑病毒，若呈橙红色则样品中无草莓潜隐环斑病毒。与现有技术相比，本专利技术的优点在于草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法，通过样品RNA提取，RT-LAMP扩增，就可以得到检测结果，整个检测反应不超过2.5 h，又由于LAMP呈瀑布式扩增，因此其扩增效率非常高，灵敏度是RT-PCR检测的100倍，且无需复杂的检测仪器和检测过程，操作简单，可现场实时检测，因此本专利技术是一种检测速度快、操作简单、检测结果判断容易和灵敏度高的草莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法。具体实施例方式以下结合实施例对本专利技术作进一步详细描述。实施例1 1、根据GenBank(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)中已登录的草莓潜隐环斑病毒的外壳蛋白基因序列(AY860979)，采用Blast程序进行同源性比较，在序列的保守区，使用Primer Express 3.0 软件,设计得到 F3、B3、FIP、BIP、Loopl 和 Loop2 共 6 条引物，分别识别外壳蛋白编码基因的8个位点；引物F3、B3、FIP、BIP、Loopl和Loop2由上海英骏生物技术公司合成，引物F3的核苷酸序列为gagaatcacc gttactggaa agg,引物B3的核苷酸序列Sacagcaaaca gagaaccact acc,引物 Loopl 的核昔酸序列为 gcaaagccca tttccacagt,引物Loop2的核苷酸序列为ggttgctacg tgccaaggtt,引物FIP的核苷酸序列为cgataggcatcgctctccct ttttagaggt gatctttaac ctccc,引物 BIP 的核苷酸序列为 tactttggttcgacagtggt ggattttccc attagataac caccataacc a ； 2、RT-LAMP扩增反应体系建立:2X反应缓冲液10 μ L，浓度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，浓度5 U/ μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，样品总RNAl μ L，引物F3和Β3终浓度各为0.2 μ Μ，引物Loopl和Loop2终浓度各为0.8 μ M，引物FIP和BIP终浓度各为1.6 μ Μ，ddH20补充至20 μ L ; Bst DNA聚合酶和AMV RNA聚合酶均购于北京美莱博医学科技有限公司； 3、反应条件优化:用上述RT-LAMP扩增反应体系对草莓潜隐环斑病毒标准样品(购于美国Agdia公司)进行扩增,扩增反应时间分别设定为:30min、60min和90min,结果30 min未看到沉淀，60min和90min都可以看到沉淀,扩增产物加0.1 μ L的突光染料SYBR greenI (购自上海生物工程公司)，都呈绿色，因此选取60 90 min的反应时间；扩增反应水浴温度分别设定为60°C、63°C和65°C，结果都可以看到沉淀，扩增反应温度优选较低的60°C ； 4、RT-LAMP特异性试验:用上述RT-LAMP扩增反应体系分别对草莓潜隐环斑病毒二个样品、烟草环斑病毒一个样品(TbAacco ringspotTRSV)、香石竹环斑病毒一个样品(.Carnation ringspot virus, CRSV)、黄瓜绿斑驳病毒一个样品green mottlemosaic virus，CGMMV)、南芥菜花叶病毒一个样品 ClraAi1S mosaic Firw1S, ArMV)和马铃薯V病毒一个样品OdWo virus K, PVV)进行扩增,上述样品均购于美国Agdia公司，反应时间60 min,水浴温度为60°C，结果草莓潜隐环斑病毒二个样品都可以看到沉淀，扩增产物加0.1 μ L的荧光染料SYBR green I，都呈绿色，其它样品无沉淀，SYBR本文档来自技高网...
【技术保护点】
草莓潜隐环斑病毒的RT?LAMP检测方法，其特征在于步骤如下：a、总RNA提取：检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA；具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行；b、RT?LAMP扩增：20μL?RT?LAMP扩增反应体系为2×反应缓冲液10μL，浓度5?U/μL?的Bst?DNA聚合酶1.5μL，浓度5?U/μL?的AMV?RNA聚合酶1μL，样品总RNA1μL，引物F3、B3、Loop1、Loop2、FIP和BIP，余量为ddH2O，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2μM，引物Loop1和Loop2的终浓度各为0.8μM，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6μM，其中引物F3的核苷酸序列为gagaatcacc??gttactggaa?agg，引物B3的核苷酸序列为acagcaaaca?gagaaccact?acc，引物Loop1的核苷酸序列为gcaaagccca?tttccacagt，引物Loop2的核苷酸序列为ggttgctacg?tgccaaggtt，引物FIP的核苷酸序列为cgataggcat?cgctctccct?ttttagaggt?gatctttaac?ctccc，引物BIP的核苷酸序列为tactttggtt?cgacagtggt?ggattttccc?attagataac?caccataacc?a，反应条件为60～65℃的恒温水浴锅中扩增1～1.5?h，得到扩增产物；?c、在扩增产物中加入0.1μL的荧光染料SYBR?green?I，若呈绿色则样品中感染有草莓潜隐环斑病毒，若呈橙红色则样品中无草莓潜隐环斑病毒。...
【技术特征摘要】
1.莓潜隐环斑病毒的RT-LAMP检测方法，其特征在于步骤如下: a、总RNA提取:检测样品经液氮处理后研碎成粉末状，用Trizol核酸提取试剂提取总RNA，得到样品总RNA ;具体提取方法依Trizol核酸提取试剂的说明书进行； b、RT-LAMP扩增:20μ L RT-LAMP扩增反应体系为2 X反应缓冲液10 μ L，浓度5 U/ μ L的Bst DNA聚合酶1.5 μ L，浓度5 U/μ L的AMV RNA聚合酶I μ L，样品总RNAl μ L，引物F3、Β3、LoopU Loop2、FIP和BIP，余量为ddH20，该扩增反应体系中，引物F3和B3的终浓度各为0.2 μ M，引物Loopl和Loop2的终浓度各为0.8 μ M，引物FIP和BIP的终浓度各为1.6 μ Μ,其中引物F3的核苷酸序列为gagaatcacc ...
【专利技术属性】
技术研发人员：张吉红，陈先锋，余澍琼，闻伟刚，
申请(专利权)人：宁波检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。