检测李坏死环斑病毒的方法技术

本发明专利技术提供了一种免疫捕获反转录ＰＣＲ检测李坏死环斑病毒（ＰＮＲＳＶ）的方法，属植物保护领域。其方案是，通过抗体特异捕获抗原、ＲＴ－ＰＣＲ以及电泳检测等步骤，对植物中感染的李坏死环斑病毒进行扩增，并通过凝胶电泳进行分离和检测。该方法除了具有普通ＲＴ－ＰＣＲ所具有的快速、特异的优点外，主要是实现了血清学与分子生物学技术的结合，先通过病毒抗体对抗原病毒的特异吸附，将植物中低浓度的病毒进行富集，再通过ＰＣＲ进行扩增，从而使检测的灵敏度和特异性得到极大的提高，并降低了病毒的漏检率。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种检测李坏死环斑病毒的方法，其步骤如下：１）设计引物：设计检测李坏死环斑病毒的引物：＊＊＊２）免疫捕获：（ａ）取１００ｍｇ感病组织，加１ｍＬ研磨缓冲液充分研磨后将研磨液转入１．５ｍＬ离心管中，４００ ０ｒｐｍ离心４ｍｉｎ，上清液即为病组织粗汁液；（ｂ）０．５ｍＬＰＣＲ管中加入１５０μＬ以包被缓冲液稀释２００倍的李坏死环斑病毒抗血清，３７℃孵育３ｈ或４℃过夜；（ｃ）弃去包被液，用ＰＢＳＴ洗涤３次，加入１５０μＬ粗汁液， ３７℃下孵育３ｈ或４℃过夜；（ｄ）用ＰＢＳＴ洗涤ＰＣＲ管３次，ｄｄＨ↓［２］Ｏ洗涤１次，低速离心１５ｓｅｃ，弃残余液体；３）ＲＴ－ＰＣＲ；（ａ）在包被过的ＰＣＲ管中加入下游引物ＰＮＲＳＶ－Ｒ１μＬ，９．５μＬ ｄｄＨ↓［２］Ｏ，轻微振荡混匀后于７０℃温育１０ｍｉｎ，之后迅速冰浴５ｍｉｎ；（ｂ）反转录：向上述ＰＣＲ管中按以下体系加入试剂，充分振荡混匀，室温放置１０ｍｉｎ，４２℃保温１ｈｒ，得到ｃＤＮＡ；＊＊＊（ｃ）ＰＣＲ：取 一新的ＰＣＲ管，按下表体系加入各试剂：＊＊＊设置ＰＣＲ程序为：９４℃４ｍｉｎ，９４℃１ｍｉｎ、５０℃～５６℃１ｍｉｎ、７２℃２ｍｉｎ，扩增３０～３８个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ后４℃保存；４）电泳检测 ：配制０．８％～２％的琼脂糖凝胶，在０．５×ＴＢＥ缓冲液环境中，１５０Ｖ稳压电泳９０ｍｉｎ，之后取出凝胶浸泡在０．５μｇ／ｍＬ溴化乙锭中染色１０ｍｉｎ，然后在紫外灯下观察并记录结果；５）结果分析：根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判 定所检测的植物中是否感染李坏死环斑病毒，即如果凝胶中存在４８３ｂｐ的核酸片段则说明样品中含有李坏死环斑病毒。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李凡，陈精兰，陈海如，李正跃，孙健，王钰丽，刘云龙，范静华，王扬，姬广海，孔宝华，蔡红，杨斌，蒋小龙，白松，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]