一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法技术

本发明专利技术公开了一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物及其方法，利用实时定量引物专用设计软件Beacon?Designer设计CTV特异性引物，摸索和优化实时荧光定量RT-PCR反应体系的条件参数等，建立一种快速有效的SYBR?Green?I荧光定量RT-PCR检测方法，并对单头橘蚜体内CTV含量进行准确的定量检测。通过融解曲线、标准曲线的扩增效率及相关系数及方法学验证结果表明该体系灵敏、快速、有效，即使橘蚜体内CTV含量低也可准确定量检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于柑橘衰退病毒(CTV)检测领域。具体涉及用于褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR检测的引物及其方法。
技术介绍
柑橘衰退病毒(Citrustristeza virus,CTV)是长线形病毒属(Closterovirus)的正义单链RNA(+ssRNA)病毒，是目前已知植物病毒基因组中最大的病毒[I]。褐色橘蚜被普遍认为是其最主要的传播介体。由CTV引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一，对柑橘产业造成了重大经济损失。监控CTV在田间的流行是控制柑橘衰退病扩大危害的重要策略之一，因此急需建立一种快速、灵敏且可靠的检测橘蚜体内CTV含量的方法，对更好的防治橘蚜传播CTV及深入研究蚜传机制有重大意义。在ELISA技术出现之前，明确蚜虫是否带毒一般通过传毒实验进行评价。血清学ELISA技术的建立推动了植物病毒的诊断，但由于非增殖型传播的病毒在昆虫体内浓度很低及血清学方法检测灵敏度较低，所以检测昆虫体内病毒比较困难。目前，PCR技术已广泛用来检测蚜虫体内带毒情况。对蚜虫体内的CTV成功检出的方法已有报道，主要有常规反转录多聚酶链式反应(reversetranscrip本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT?PCR的引物，其特征在于：其特异性引物为HD?F和HD?R，其核苷酸序列分别如SEQ?ID?NO.1和2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于:其特异性引物为HD-F和HD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.1和2所示。2.根据权利要求1所述一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的引物，其特征在于，所述外侧引物为LD-F/LD-R，其核苷酸序列分别如SEQ ID N0.3和4所示。3.一种检测褐色橘蚜体内CTV实时荧光定量RT-PCR的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)引物的设计:根据Genbank中CTVP25基因保守序列，利用BeaconDesigner 7设计引物HD-F/HD-R及其外侧引物对LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast进行比对，保证引物的特异性，在LD-F前加T7启动子序列和保护碱基得引物LD-T7-F，引物对LD-T7-F/LD-R构建标准品cRNA ； (2)褐色橘蚜总RNA的提取； (3)目的基因的扩增与鉴定； (4)标准品cRNA的制备； (5)建立荧光定量RT-PCR体系，所述荧光定量RT-PCR体系中退火温度为60°C;引物浓度为600nm,体系如下: 5μ I 反转录体系为:2XTS ReAction Mix 2.5 μ I ； TrAnsScr iptTM/RI EnzymeMix0.25 μ I ；gDNA Remover 0.25 μ I ;HD_R 0.25 μ I ；ddH20 0.25 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金香，李玲娣，周常勇，李中安，田晓，
申请(专利权)人：中国农业科学院柑桔研究所，
类型：发明
国别省市：