齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法技术

本发明专利技术公开了一种齿兰环斑病毒（Ｏｄｏｎｔｏｇｌｏｓｓｕｍ?Ｒｉｎｇｓｐｏｔ?Ｖｉｒｕｓ，ＯＲＳＶ）外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法。利用原核表达系统表达齿兰环斑病毒的外壳蛋白，用原核表达的齿兰环斑病毒外壳蛋白免疫兔子、ＢＡＬＢ／Ｃ鼠制备其多抗血清，利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体，并用制备的抗体建立了检测ＯＲＳＶ高度特异性、灵敏性和正确性的的免疫捕获ＲＴ－ＰＣＲ及ＥＬＩＳＡ方法。为该病毒病的诊断、抗病育种和脱毒苗的培育提供技术支持。本发明专利技术提供的齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达及其抗体制备方法为兰环斑病毒的快速检测诊断、分型和分子生物学研究提供物质基础和技术支撑，为该兰花病毒病的防治打下基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术所属的领域为生物
，尤其是涉及一种。
技术介绍
齿兰环斑病毒(Odontoglossum Ringspot Virus, 0RSV)隶属烟草花叶病毒属(Tobamovirus)，是严重危害世界各地兰科植物的主要病毒之一。研究发现齿兰环斑病毒常与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic Potexvirus， CymMv)形成复合感染，使兰花叶片形成不规则的褪绿条纹、圆斑、环斑甚至坏死等症状，导致植物生长不良、花小而少，花期縮短，使兰花的观赏价值和经济价值大为下降，自1951年首次发现ORSV以来，该病毒受到各兰花种植国的普遍关注。近年来，随着兰花产业的发展，该病毒在全球范围内广为传播，给兰花种植业造成极大的损失，在我国海南、广东、浙江、江苏、云南等地也有该病毒的报道。因而迫切需要建立快速、准确、简单方便的检测方法，为该病毒病的诊断和防治，脱毒种苗的生产提供技术支撑和物质支持。由于齿兰环斑病毒常常与建兰花叶病毒形成复合感染，故很难通过分离纯化病毒来制备高质量的抗体，本专利通过原核表达系统表达ORSV的外壳蛋白，并利用纯化的蛋白免疫兔子、BALB/C鼠来制备该病毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达方法，其特征在于包括如下步骤：　　１）根据ＧｅｎＢａｎｋ中的编码ＯＲＳＶ外壳蛋白基因的全长序列Ｎｏ．ＥＵ６８３８７９设计引物，上游引物为ＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＴＴＡＣ，下游引物为ＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＧＴＡ；　　２）利用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取齿兰环斑病毒兰花病叶的总ＲＮＡ；　　３）ＲＴ－ＰＣＲ克隆ＯＲＳＶ外壳蛋白基因：用下游引物按照ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ逆转录试剂盒合成ＯＲＳＶ外壳蛋白基因第一链ｃＤＮＡ进行，利用上述设计的一对引物，以合成的ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，克隆ＯＲＳＶ外壳蛋白基因；　　４）ＯＲＳＶ外壳蛋...

【技术特征摘要】
一种齿兰环斑病毒外壳蛋白基因的表达方法，其特征在于包括如下步骤1)根据GenBank中的编码ORSV外壳蛋白基因的全长序列No.EU683879设计引物，上游引物为CGGGATCCATGTCTTACACTATTAC，下游引物为CGGTCGACTTAGGAAGAGGTCCAAGTA；2)利用Trizol试剂提取齿兰环斑病毒兰花病叶的总RNA；3)RT-PCR克隆ORSV外壳蛋白基因用下游引物按照RevertAidTM逆转录试剂盒合成ORSV外壳蛋白基因第一链cDNA进行，利用上述设计的一对引物，以合成的cDNA为模板进行PCR扩增，克隆ORSV外壳蛋白基因；4)ORSV外壳蛋白基因按正确的读码框插入到原核表达载体pET-32a中，构建成重组原核表达载体pET-32a-CP；5)将重组载体pET-32a-CP转化入大肠杆菌BL21(DE3)菌株；6)用IPTG诱导表达4-6h，离心收集菌体，菌体经超声波破碎，收集上清用Ni+NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。2. —种齿兰环斑病毒抗体的制备方法，其特征在于备包括如下步骤1) 用权利要求1所述方法表达的齿兰环斑病毒外...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴建祥，洪健，孟春梅，荣松，张超，
申请(专利权)人：浙江大学，浙江传化生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]