应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，涉及一种应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟病毒进行定量检测的方法。本发明专利技术通过从含有猪瘟病毒的组织或细胞培养液中提取RNA核酸，应用自行设计的引物和探针特异性检测并定量猪瘟病毒。本发明专利技术包括设计的特异性引物序列和荧光探针序列，以及与之配套的定量PCR反应体系和反应程序，及检测样品的结果判定方法。本发明专利技术并解决了传统检测猪瘟兔化弱毒疫苗株使用的活兔体定型热方法存在的各种不足，可以快速对猪瘟病毒进行检测和定量，用于猪瘟疫苗质量监控及合理化配苗等领域，并可为猪瘟病毒的早期快速诊断提供有力的工具，具有快速，准确、特异性好、灵敏度高的优点，可以进行定性、定量检测，具有很强的推广性和实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检验
，具体是一种应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒(Hog cholera lapinized virus, HCLV)疫苗株进行定量检测的方法。
技术介绍
I猪瘟病毒(CSFV)的实验室检验技术国内对CSFV的传统诊断方法包括:免疫荧光试验、细胞分离培养试验、动物接种试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、血清学方法等。这些方法都存在自身明显的不足之处，很难对猪瘟病毒进行快速、灵敏的检测。2猪瘟病毒的疫苗生产过程中所用检验方法现况疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标，对HCLV疫苗的效价测定一直沿用兔体定型热反应法(兔热法)。但该法存在的突出不足是:不能准确定量；测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响；实验周期长、费时费力。由于不能准确的定量病毒，所以不能准确科学的进行疫苗成品的配制，结果就是疫苗产品质量不稳定，有效病毒含量高的批次浪费抗原，有效病毒含量低的批次起不到良好的疫苗保护效果。
技术实现思路
为了实现对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行快速准确的定量检测，本专利技术提供了应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟 兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法。本专利技术提供的应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法，采用Taqman探针法实时荧光定量PCR进行定量检测，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，Taqman突光探针序列如SEQ ID N0:3所示。优选地，Taqman荧光探针序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记为TAMRA0所述方法可以包括以下步骤:(I)提取待测样品的RNA核酸；(2)配置定量PCR反应液；(3)将待测样品的核酸加入步骤(2)配置的反应液中，制得到反应体系；(4)配制标准品PCR反应液，将标准品按梯度稀释，每个稀释梯度液取液加入步骤(2)配置的反应液中，制得反应体系；(5)将配置的反应液置于定量PCR仪中，运行定量PCR检测反应程序；(6)扩增反应结束后，结合PCR所给出标准曲线计算待测样品中RNA模板拷贝数，并由此计算待测样品中猪瘟病毒具体含量。下面是各步骤可以分别或者结合采用的具体操作方法。步骤(I)按照常规TRIZol试剂法提取待测样品的RNA核酸。步骤(3)和(4)所述的反应体系包括:PCR MIX12.5yL，10ym/L的上游引物0.5 μ L, 10 μ m/L的下游引物0.5 μ L，样品的核酸I μ L，超纯水10.5 μ L。步骤(4)的标准品为RNA片段，序列如SEQ ID NO:4所示。步骤(4)将标准品按10倍的梯度稀释，依次含有标准品RNA拷贝数为108，107, 106,105, 104, 103O步骤(5)所述的定量PCR检测反应程序包括:42°C反转录30min，95°C预变性3min ;94°C变性10s，65°C退火及延伸15s，45个循环。与现有支原体检测方法相比，本专利技术主要优点在于:(I)特异性高:一对引物对猪瘟病毒基因组特异性区域的识别保证PCR扩增的高度特异性。(2)检测周期短:PCR检测方法可以4个小时得出结果，而传统兔热方法检测周期要120小时。(3)稳定性高:同一样品的不同检测批次，不同人员操作，其结果一致性强，适合大规模、高通量的样品分析，一次可处理样品几十个。本专利技术具有以下意义:I为猪瘟病毒的早期快速诊断提供有力的工具应用荧光定量PCR技术取代传统的细胞培养法成为检测猪瘟病毒的最理想的标准，为猪瘟病毒的早期快速诊断提供有力的工具。2准确定量猪瘟兔化弱毒从而科学的合理比例配苗本专利技术用于猪瘟兔化弱毒疫苗的定量检测，通过与传统兔热法进行比较，建立了更为科学准确的定量检测猪瘟兔化弱毒的方法，并应用于猪瘟疫苗质量监控及合理化配苗等领域。本方法可以快速准确的对猪瘟兔化弱毒株病毒进行定量，整个定量检测过程可在4h内完成，并且操作简单快速具有良好的重复性，对全血样品及猪体组织或细胞培养物都有良好的适应性。可以成为检测猪瘟病毒的理想的标准，代替传统兔热法对猪瘟病毒进行定量，使猪瘟兔化弱毒疫苗配苗更为合理和准确。不但可以代替传统兔热法应用到CSFV的检测及疫苗生产准确配比等方面，提高疫苗产品质量、降低生产成本。具体实施例方式本专利技术的应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法采用Taqman探针法，使用自行设计的一对引物及一条探针，标准品为自行构建质粒并转录的一段383bp的RNA片段(序列如SEQ ID NO:4所示)建立实时定量PCR反应体系和反应程序，梯度稀释标准品进行定量PCR实验并绘制标准曲线，最后建立待测样品的结果判定依据。具体为，从GenBank基因数据库中检索获得猪瘟病毒石门系强毒株(Hog choleravirus strain Shimen)和中国猪痕兔化弱毒疫苗株(Hog cholera lapinized virus,HCLV)全基因组序列，通过DNA star软件进行序列比对分析，在其5’端UTR (非编码区)保守区设计一对特异性扩增引物，上游引物序列(SEQ ID N0:l):5’ -CCATGCCCATAGTAGGA-3’，下游引物序列(SEQ ID N0:2):5，-GTCCACGTAGCATCTCG-3’，PCR 扩增产物大小 137bp。所设计的Taqman 突光探针序列(SEQ ID NO:3):5’ -tgagtacaggacagtcgtcagtagttcgacg-3’，其5’端标记的突光报告基团为FAM(6_羧基突光素)，3’端标记淬灭基团 TAMRA (6_ 竣基四甲基丹诺明)，即，5’ -FAM-tgagtacaggacagtcgtcagtagttcgacg-TAMRA-3，。本专利技术的应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法一具体的实施方式包括:(1)按照常规TRIZol试剂法提取待测样品的RNA核酸；(2)配置定量PCR反应液，包括:PCR MIX12.5 μ L，10 μ m/L的上游引物0.5 μ L，10 μ m/L的下游引物0.5 μ L，超纯水10.5 μ L ；(3)取2μ L待测样品的核酸加入步骤(2)配置的反应液中，得到25μ L反应体系，混匀反应液，短暂离心；(4)配制标准品PCR反应液，将标准品按10倍比稀释，依次含有标准品RNA拷贝数为IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3,每个稀释梯度液取I μ L加入步骤(2)配置的反应液中，得到25 μ L反应体系,混匀反应液,短暂离心；(5)将配置的反应液置于定量PCR仪中，进行定量PCR检测反应程序，包括:42°C反转录30min，95°C预变性3min ;94°C变性10s，65°C退火及延伸15s，45个循环；(6)扩增反应结束后，结合PCR所给出标准曲线计算待测样品中RNA模板拷贝数。并由此计算待测样品中猪瘟病毒具体含量。举例:猪瘟病毒悬浮培养毒液用本方法测毒及结果一、样品说明本次检测样品为猪瘟悬浮培养毒液，各样品分别为猪瘟病毒悬浮培养过程中不同培养时间抽取的毒液样品，比如第一次收获前培养到24小时抽取的毒液样品命名为“一收24h”，按此命名方法本次共检测样品9个，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
应用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法，其特征在于，采用Taqman探针法实时荧光定量PCR进行定量检测，上游引物序列如SEQ?ID?NO:1所示，下游引物序列如SEQ?ID?NO:2所示，Taqman荧光探针序列如SEQ?ID?NO:3所示。

【技术特征摘要】
1.用实时荧光定量PCR技术对猪瘟兔化弱毒疫苗株进行定量检测的方法，其特征在于，采用Taqman探针法实时荧光定量PCR进行定量检测，上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示，Taqman突光探针序列如SEQ ID N0:3所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Taqman荧光探针序列5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记为TAMRA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)提取待测样品的RNA核酸； (2)配置定量PCR反应液； (3)将待测样品的核酸加入步骤(2)配置的反应液中，制得到反应体系； (4)配制标准品PCR反应液，将标准品按梯度稀释，每个稀释梯度液取液加入步骤(2)配置的反应液中，制得反应体系； (5)将配置的反应液置于定量PCR仪中，运行定量PCR检测反应程序； (6)扩增反应结束后，结合PCR所给出标准曲线计算待测样品中RNA模板拷...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐师军，张贵刚，刘国英，张领月，郭伟，范秀丽，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：