本发明专利技术涉及一种利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术方法包括特异性引物的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化、样本DNA提取及结果检测判定。本发明专利技术检测灵敏度高，稳定性高、特异性好，可以检测样本中类猪圆环病毒P1的含量，同时可以鉴别样本中猪圆环病毒2型的感染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种类猪圆环病毒Pl (即是类猪圆环病毒2型因子P1，见温立斌等，一株类猪圆环病毒2型因子Pl的全基因组序列测定与分析，中国农业科学，2010年02期，41Γ416)的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，属于分子生物学领域。
技术介绍
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属，为单股环状DNA病毒，是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCVl和PCV2。PCVl为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，可引起圆环病毒相关疾病，其中最 重要的是猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)。本病最早发现于加拿大(1991)，很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS (猪皮炎与肾病综合征)、PNP (增生性坏死性肺炎)、PRDC (猪呼吸道疾病综合征)、繁殖障碍、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。此外，PCV2感染可导致机体免疫抑制，引起免疫失败以及继发感染，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为引起猪免疫障碍的重要传染病(Segal^ s等Porcine circovirusdiseases . Anim Health Res Rev, 2005, 6: 119 - 142)。类猪圆环病毒Pl是新近发现的病毒，可引起感染猪出现类似PMWS症状(Wen 等 A novel porcine circovirus-like agent Pl is associated with wastingsyndromes in pigs. PLoS ONE 2012，7(8) : e41565)。它不仅拥有单股环状DNA基因组，而且其核苷酸序列大部分与PCV2的高度同源(Wen等Complete genome sequence of anovel porcine circovirus-like agent. J Virol. 2012, 86(1): 639XSYBR Green I 是一种双链DNA结合染料，其特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。与其他实时荧光定量PCR技术相比，SYBR Green I在核酸的实时检测方法有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，而且通过融解曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，区分非特异性扩增。由于Pl拥有与PCV2高度同源的序列，目前报道的诊断Pl的定量PCR方法尚无法鉴别Pl和PCV2，只能结合普通PCR结果综合判断(温立斌等SYBR Green I荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子Pl.华北农学报.2009，4:31-35)。本专利技术利用反向PCR原理，设计新型特异性引物，采用的绝对定量技术，为样本中类猪圆环病毒Pl载量消长规律等方面的研究提供方法，为Pl流行病学监测、致病机理的研究提供技术支持。同时还可区分Pl与PCV2的感染提供技术平台。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是克服现有技术中存在的上述不足，提供一种类猪圆环病毒Pl的荧光定量PCR检测引物和方法。该方法的检测灵敏度可达IO1个拷贝的病毒分子，具有良好的特异性和重复性。不仅可对Pl进行定量，还可对PCV2定性加以鉴别，从而为类猪圆环病毒Pl的检测和监控提供有效方法。技术方案 一种类猪圆环病毒Pl的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于， 上游引物5’ AAGACCCCCCACTTAAACCC 3’ ； 下游引物5’ GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT 3’ 其目的扩增片段为119 bp,扩增序列具体如下 AAGACCCCCCACTTAAACCCTAAATGAGGATCCACTAGTAACGGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGCTACCGTTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTC。 所述的引物用于类猪圆环病毒Pl的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法为 (O定量标准质粒的构建与制备 以提取的类猪圆环病毒Pl DNA为模板，用上游引物和下游引物进行PCR扩增含有靶序列的基因片段，PCR反应体系为2 XPCR TaqMix 12. 5 μ L、50 μ mol/L的上游引物O. 25 μ L、50ymol/L的下游引物0. 25 μ L, DNA模板2. 5 μ L、无菌双蒸水9. 5 μ L，总反应体系为25 μ L ； 反应条件为94°C预变性5min，94°C变形30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35个循环，72°C延伸10 min。PCR反应结束后，产物于质量比2%琼脂糖凝胶中进行电泳； PCR产物经电泳鉴定后，通过胶回收纯化目的片段，然后将目的片段119 bp与pMD18-T载体连接，转化DH5 α感受态细胞，进行测序鉴定，重组质粒用质粒小提试剂盒进行提纯，获得定量标准质粒； (2)抽提样品病毒DNA，与标准质粒按照以下定量PCR反应体系和程序进行扩增 PCR反应体系为12.5yL 2 X UltraSYBR Mix, 10 μ M正向引物、反向引物各O.025 μ L，待测样品的DNA 2 μ L，补充双蒸水至25 μ L ; PCR 反应程序为95°C IOmin; 95V 15 sec, 60°C 30 sec,进行 40 个循环； 待测样品的结果判定当待测样品实时荧光定量PCR检测结果有“S”型扩增曲线，Ct值彡34. O且Tm值介于82. (TC——83. (TC之间时，判定待测样品中含有类猪圆环病毒Pl。有益效果 本专利技术采用SYBR Green I荧光定量PCR进行类猪圆环病毒Pl的检测，具有以下优点和效果 I.检测快速、高效该检测方法在PCR反应结束后，可立即通过仪器自带软件进行结构判定，不需要琼脂糖凝胶电泳、EB染色来观察结果，减少了环境污染和样品交叉污染，从核酸提取到结果判定仅需3小时，一次可以进行96个样品的检测。2.准确定量通过制备标准品及绘制标准曲线，再根据待测样品的Ct值，可以对待测样品中的类猪圆环病毒Pl进行定量，准确度高。3.精确定量，灵敏度闻在标准品IOci IO8拷贝范围内都有极好的线性关系，检测范围可达9个数量级，检测下限可达10个拷贝以下，具有极高的灵敏度。4.特异性强特异性引物可与类猪圆环病毒Pl特异性结合，与PCV2虽然也可结合，但通过融解曲线分析，可以鉴别PCV2的感染，解决了以前定量PCR技术无法鉴别Pl与PCV2混合感染的问题。附图说明图I.类猪圆环病毒Pl绝对定量的标准曲线示意图 图2.实施例中荧光定量PCR特异性检测的融解曲线图(A) PI; (B)PCV2; (C-E)PRV, PRRSV 和 PPV具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应当理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。本领域的技术人员本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种类猪圆环病毒P1的SYBR？Green？I实时荧光定量PCR检测引物，其特征在于，上游引物：？5“？AAGACCCCCCACTTAAACCC？3“？；下游引物：？5“？GAGAGGCGGGTGTTGAAGAT？3“其目的扩增片段为119？bp。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：温立斌，何孔旺，高晓静，王小敏，李彬，郭容利，俞正玉，茅爱华，倪艳秀，张雪寒，吕立新，周俊明，胡屹屹，汪伟，叶青，祝昊丹，于洋，沈江萍，周萍，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：
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