本发明专利技术公开了一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，所述试剂盒包括：包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQ ID NO:1‑37；所述探针的序列为SEQ ID NO:38‑55。本发明专利技术基于PCR技术，针对16种呼吸道病原体的保守区域设计引物对靶核酸序列进行扩增，并通过基因芯片杂交技术对扩增产物进行杂交和显色，最后将基因芯片上杂交斑点显色情况与标准卡进行对比，从而对检测结果进行分析判断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法。
技术介绍
呼吸道感染是世界范围内最常见的疾病之一，发病率在各国居民发病率总体结构中占据主要地位，每年的流行高峰期约有10％的居民患有呼吸道感染。呼吸道感染会导致鼻炎，流涕，鼻塞，咳嗽，轻度咽炎，全身发热等症状，严重的会导致呼吸困难甚至死亡。据世界卫生组织2002年统计报告，呼吸道感染居全球十大死亡原因中第三位，全球每年近四百万人死于呼吸道感染。基因芯片技术是近年来兴起的生物高新技术，集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、精密控制技术、激光共聚焦显微技术和高分子合成技术。该技术的原型是80年代中期提出的，1991年StephenFodor博士首次将该技术定义为基因芯片，到1995年它在《Science》杂志刊登的一篇关于研究分析基因表达图谱的文章中再次被提及，目前该技术在研究癌症和检测微生物方面得到广泛的应用。我们通常所提到的基因芯片(又称DNA芯片、寡核苷酸芯片等)是指根据经过特殊处理技术，将核酸分子(寡聚核苷酸、DNA、RNA等)固定于硅片、玻璃、尼龙膜等固相载体上，利用生物分子间特异相互作用的原理，将生化反应及分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA的高通量快速检测。其突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和高度自动化。目前国内已有许多检测呼吸道病原体的试剂。主要是针对于病毒类的PCR荧光检测试剂或者血清免疫检测试剂，而对于细菌类病原体还是采取了比较传统的细菌培养板培养的方法。荧光PCR虽然能够得到较好的灵敏度和特异性，但是由于仪器采集信号通道的限制，每次反应都只能检测几种病原体，通量较低，而采取多管检测的时候又会极大增加检测的经济成本和时间成本；而血清免疫检测试剂虽然可以获得较大的检测通量，但是由于血清免疫检测的是血清中的所产生的抗体，因此存在着一个较长的空窗期，并且灵敏度相对也较低；而对于细菌类病原体的检测则是更加困难，细菌培养法虽然准确率高，但是周期长，培养效果差，很多细菌无法培养，延误了最佳的治疗时机。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，以实现同时检测16种呼吸道病原体的检测需要。根据本专利技术的实施例，第一方面示出一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，所述试剂盒包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQIDNO:1-37；所述探针的序列为SEQIDNO:38-55。进一步，每条所述杂交探针的5’末端都经过氨基与多聚polyT修饰。进一步，每条所述杂交探针的5’端oligodT的C6位置进行氨基化修饰。本专利技术第二方面示出一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法，包括：筛选出16种呼吸道病原体的保守区域，分别得到16对引物，在所述16种呼吸道病原体的保守区域设计出16条杂交探针；选取方形尼龙膜，使用10％EDC活化1h，将所述16条杂交探针、1种DNA内标探针、1种RNA内标探针点在尼龙膜上，探针排列为3×6矩阵，点与点之间的间距为100μm，得到杂交盒；配置检测试剂盒，设置PCR反应扩增的程序，进行扩增反应，得到扩增产物；向所述扩增产物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到变性后的扩增产物；在杂交盒每孔内加入500uL预杂交液，15min后取出在杂交盒中预杂交液，在杂交盒每孔内加入杂交液400uL，同时相应的加入所述变性后的扩增产物100uL，将杂交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔内的杂交液；在杂交盒每孔内加入500ul杂交洗液1清洗3min，移出杂交洗液1；在杂交盒每孔内加入300ul酶标溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶标溶液；在杂交盒每孔内加入500uL杂交洗液1，震荡清洗3min，用500uL杂交洗液2，震荡清洗3min；在杂交盒每孔内加入400ul显色液，室温显色1-2min，移出显色液，用杂交洗液2清洗每孔，用Bio-rad显影，得到杂交显色结果；将所述杂交显色结果与标准卡进行对比，得出检测结果；所述杂交洗液1为2xSSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合溶液；所述杂交洗液2为0.5xSSC与0.1％十二烷基硫酸钠溶液的混合液溶液。进一步，所述PCR反应扩增的程序为：逆转录，逆转录的温度为50℃。时间为30min；cDNA预变性，预变性的温度为90℃-105℃，时间为1-10min，变性，变性的温度为90℃-105℃，时间为10s-30s；退火，退火的温度为40℃-65℃，时间为10s-60s；延伸，延伸温度为40℃-80℃，时间为10s-5min。进一步，所述PCR反应扩增的程序为：所述逆转录的温度为50℃。时间为30min；所述预变性的温度为95℃，时间为2min，所述变性的温度为95℃，时间为15s；所述退火的温度为57℃，时间为20s；延伸温度为72℃，时间为45s。进一步，在每条所述引物的5’端添加人工接头序列。进一步，所述酶标溶液为链霉亲和素和酶标母液的混合液；按照链霉亲和素酶标母液＝1:200的配制。进一步，所述显色液为2mg/mlTMB：显色缓冲液：30％H2O2＝500:500:1。进一步，所述预杂交液、所述杂交液、所述杂交洗液1，所述杂交洗液2和所述酶标溶液使用前在55℃烘箱中预热30min。由以上技术方案可知，本专利技术实施例示出一种检测16种呼吸道病原体的基因芯片检测用试剂盒及方法，所述试剂盒包括：包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQIDNO:1-37；所述探针的序列为SEQIDNO:38-55。本专利技术基于PCR技术，针对16种呼吸道病原体的保守区域设计引物(SEQIDNO:1-37)对靶核酸序列进行扩增，并通过基因芯片杂交技术对扩增产物进行杂交和显色，最后将基因芯片上杂交斑点显色情况与标准卡进行对比，从而对检测结果进行分析判断，同时为了避免由于样本提取或者试剂失效导致的假阴性结果，本专利技术设置了人源管家基因(在取样过程中会取到人源上皮细胞)作为内标质控，对靶核酸的提取和扩增进行监控，从而保证检测结果的精确性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为根据一优选实施例示出的一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，包括：本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，其特征在于，包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQ ID NO:1‑37；所述探针的序列为SEQ ID NO:38‑55。
【技术特征摘要】
1.一种检测16种呼吸道病原体的基因检测试剂盒，其特征在于，包括：PCR缓冲溶液、逆转录酶、dNTPs、引物、探针以及Taq酶和金属阳离子；所述探针包括杂交探针和内标探针；所述引物包括16种呼吸道病原体引物和2种内标引物和1种通用引物；所述引物的序列为：SEQIDNO:1-37；所述探针的序列为SEQIDNO:38-55。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每条所述杂交探针的5’末端都经过氨基与多聚polyT修饰。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每条所述杂交探针的5’端oligodT的C6位置进行氨基化修饰。4.一种检测16种呼吸道病原体的基因检测方法，其特征在于，包括：筛选出16种呼吸道病原体的保守区域，分别得到16对引物，在所述16种呼吸道病原体的保守区域设计出16条杂交探针；选取方形尼龙膜，使用10％EDC活化1h，将所述16条杂交探针、1种DNA内标探针、1种RNA内标探针点在尼龙膜上，探针排列为3×6矩阵，点与点之间的间距为100μm，得到杂交盒；配置检测试剂盒，设置PCR反应扩增的程序，进行扩增反应，得到扩增产物；向所述扩增产物中加入0.2mol的NaOH50uL，得到变性后的扩增产物；在杂交盒每孔内加入500uL预杂交液，15min后取出在杂交盒中预杂交液，在杂交盒每孔内加入杂交液400uL，同时相应的加入所述变性后的扩增产物100uL，将杂交盒放入55℃烘箱中，30min后取出移出孔内的杂交液；在杂交盒每孔内加入500ul杂交洗液1清洗3min，移出杂交洗液1；在杂交盒每孔内加入300ul酶标溶液，置于37℃烘箱中，30min后移出酶标溶液；在杂交盒每孔内加入500u...
【专利技术属性】
技术研发人员：纪博知，蒋贤杰，余斌，刘佳，邓中平，陈晓亮，戴立忠，
申请(专利权)人：湖南圣湘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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