一种联合检测多种性病病原体DNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，GP和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针、IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。本发明专利技术的检测方法可以同时定性检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、人型支原体共9种常见性病病原体DNA，检测性病病原体多，方法简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种联合检测多种性病病原体DNA的方法。
技术介绍
性传播感染是引起全球急性疾病、不孕、长期残疾和死亡的一个主要因素，给成千上万的成人和婴儿造成严重的医疗与心理后果。至今已经有超过30种细菌、病毒和寄生虫等病原体被证实可以通过性接触途径传播。世界卫生组织(WHO)统计2008年全球和区域15-49岁成年人中4种可治愈性病(沙眼衣原体感染、淋病、梅毒和阴道毛滴虫病)发病与患病估计数。2008年全球15-49岁成年人的4种性病新发病例总数约为4.989亿，其中沙眼衣原体感染1.057亿，淋病1.061亿，阴道毛滴虫病2.764亿。此外，在2008年的任一时点上估计有1.004亿成年人患沙眼衣原体感染，3640万患淋病，1.87亿患阴道毛滴虫病。中国疾病预防控制中心性病控制中19家哨点门诊2012年10至2013年2月共报告5种性病2580例，为生殖道沙眼衣原体感染418例，占16.23％；淋病407例，占15.81％；生殖器疱疹140例，占5.44％。因此，开发对多种性病病原体的联合检测方法对性病的诊断非常重要。
技术实现思路
有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种联合检测多种性病病原体DNA的方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，包括以下步骤：(1)、使用商品化的细菌DNA提取试剂盒(如天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒)提取生殖泌尿道分泌物棉拭子样本的基因组DNA，取1.0mL或以上体积无菌生理盐水漂洗棉拭子样本，转移至1.5mL离心管中，12000rpm/min离心10min，小心去除干净上清液避免扰动或触动到沉淀，可多次收集沉淀；沉淀按天根细菌基因组小量DNA制备试剂盒提取，提取方法按说明书第二步开始操作，最后用50μL洗脱液洗脱；(2)、以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，通用引物GP1、GP2和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针，IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；所述待测性病病原体为沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、和人型支原体；所述通用引物GP1具有如SEQIDNO:1所示的碱基序列，所述通用引物GP2具有如SEQIDNO:2所示的碱基序列；所述GPSP引物为针对IAC的SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、以及针对沙眼衣原体的SEQIDNO:3和SEQIDNO:4、针对淋球菌的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、针对阴道毛滴虫的SEQIDNO:7和SEQIDNO:8、针对HSVII的SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、针对生殖支原体的SEQIDNO:13和SEQIDNO:14、针对HSVI的SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、针对人型支原体的SEQIDNO:17和SEQIDNO:18、针对解脲脲原体的SEQIDNO:19和SEQIDNO:20、和针对微小脲原体的SEQIDNO:19和SEQIDNO:21中的一对以上；所述特异性探针为针对IAC的SEQIDNO:30、以及针对沙眼衣原体的SEQIDNO:26、针对淋球菌的SEQIDNO:27、针对阴道毛滴虫的SEQIDNO:28、针对HSVII的SEQIDNO:29、针对生殖支原体的SEQIDNO:22、针对HSVI的SEQIDNO:23、针对人型支原体的SEQIDNO:25、针对解脲脲原体的SEQIDNO:24、和针对微小脲原体的SEQIDNO:24中的一条以上；(3)、实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与步骤(1)的PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。在其中一些实施例中，所述多重PCR反应的反应体系为25.0μL，具体成分如下：在其中一些实施例中，所述多重PCR反应的反应程序为：95℃，预变性10min；95℃，15sec，50-60℃，30sec，72℃，30sec，10个循环；95℃，20sec，61-72℃，2min，20个循环；95℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，30个循环。在其中一个实施例中，所述多重PCR反应的反应程序为：95℃，预变性10min；95℃，15sec，55℃，30sec，72℃，30sec，10个循环；95℃，20sec，72℃，2min，20个循环；95℃，15sec，60℃，30sec，72℃，30sec，30个循环。在其中一些实施例中，所述特异性探针的两端分别标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团。在其中一些实施例中，上述步骤(3)所述熔解曲线的分析程序为：95℃，2min，45℃，2min，50℃-85℃阶段每0.5-1.0℃采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。在其中一些实施例中，所述样本为生殖泌尿道分泌物棉拭子(男性生殖泌尿道分泌物棉拭子、女性生殖道分泌物棉拭子、女性尿道分泌物棉拭子)、尿道口或患病部位刮片。本专利技术的性病病原体的DNA的多重检测方法采用了荧光PCR熔解曲线法，其基本原理是：本专利技术设计了分别与沙眼衣原体(CT)、淋球菌(NG)、生殖支原体(MG)、阴道毛滴虫(TV)、HSVI、HSVII、解脲脲原体(UU)、微小脲原体(UP)、人型支原体(MH)共9种常见性病病原体靶点互补的不同荧光标记探针，其两端分别标记有荧光基团与淬灭基团，在PCR体系中加入探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列；在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得探针与该序列杂交产物的熔解曲线，并得出熔点(Tm值)；从而检测出感染相应的病原体DNA。本专利技术所采用的荧光PCR熔解曲线法具有通量大、敏感性高、特异性强、重复性好、操作简单、灵活性强、应用范围广的优点，是临床上准确、高效而实用的常见性病病原体的DNA的检测方法。与现行临床使用的检测试剂相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的检测方法可以同时定性检测沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、人型支原体共9种常见性病病原体DNA，检测性病病原体多，方法简单。附图说明图1本专利技术的联合检测多种性病病原体DNA的方法的流程图；图2为实施例1中内控对照及各性病病原体的Tm值及对应荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，GP1、GP2和GPSP引物作为扩增引物，特异性探针作为探针，IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；(2)、所述待测性病病原体为沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、和人型支原体；所述引物GP1具有如SEQ ID NO:1所示的碱基序列，所述引物GP2具有如SEQ ID NO:2所示的碱基序列；所述GPSP引物为针对IAC的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、以及针对沙眼衣原体的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、针对淋球菌的SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、针对阴道毛滴虫的SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、针对HSVII的SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、针对生殖支原体的SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、针对HSVI的SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16、针对人型支原体的SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、针对解脲脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20、和针对微小脲原体的SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:21中的一对以上；所述特异性探针为针对IAC的SEQ ID NO:30、以及针对沙眼衣原体的SEQ ID NO:26、针对淋球菌的SEQ ID NO:27、针对阴道毛滴虫的SEQ ID NO:28、针对HSVII的SEQ ID NO:29、针对生殖支原体的SEQ ID NO:22、针对HSVI的SEQ ID NO:23、针对人型支原体的SEQ ID NO:25、针对解脲脲原体的SEQ ID NO:24、和针对微小脲原体的SEQ ID NO:24中的一条以上；所述IAC质粒具有如SEQ ID NO：31的碱基序列；(3)、实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与步骤(1)的PCR产物的熔解曲线，得出熔点Tm值，通过特异性探针标记的荧光通道及Tm值确定相应的感染的性病病原体。...

【技术特征摘要】
1.一种联合检测多种性病病原体DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、以提取的待测性病病原体样本的基因组DNA作为模板，GP1、GP2和GPSP引物作为扩
增引物，特异性探针作为探针，IAC质粒作为内控对照，进行多重PCR反应，得到PCR产物；
(2)、所述待测性病病原体为沙眼衣原体、淋球菌、生殖支原体、阴道毛滴虫、HSVI、
HSVII、解脲脲原体、微小脲原体、和人型支原体；
所述引物GP1具有如SEQIDNO:1所示的碱基序列，所述引物GP2具有如SEQIDNO:2所
示的碱基序列；
所述GPSP引物为针对IAC的SEQIDNO:11和SEQIDNO:12、以及针对沙眼衣原体的SEQ
IDNO:3和SEQIDNO:4、针对淋球菌的SEQIDNO:5和SEQIDNO:6、针对阴道毛滴虫的SEQ
IDNO:7和SEQIDNO:8、针对HSVII的SEQIDNO:9和SEQIDNO:10、针对生殖支原体的SEQ
IDNO:13和SEQIDNO:14、针对HSVI的SEQIDNO:15和SEQIDNO:16、针对人型支原体的
SEQIDNO:17和SEQIDNO:18、针对解脲脲原体的SEQIDNO:19和SEQIDNO:20、和针对
微小脲原体的SEQIDNO:19和SEQIDNO:21中的一对以上；
所述特异性探针为针对IAC的SEQIDNO:30、以及针对沙眼衣原体的SEQIDNO:26、针
对淋球菌的SEQIDNO:27、针对阴道毛滴虫的SEQIDNO:28、针对HSVII的SEQIDNO:29、
针对生殖支原体的SEQIDNO:22、针对HSVI的SEQIDNO:23、针对人型支原体的SEQID
NO:25、针对解脲脲原体的SEQIDNO:24、和针对微小脲原体的SEQIDNO:24中的一条以
上；
所述IAC质粒具有如SEQIDNO：31的碱基序列；
(3)、实时监测荧光值的变化，计算荧光值与温度的负导数，获得特异性探针与步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄劭，钟田雨，张家剑，
申请(专利权)人：赣南医学院第一附属医院，江西耀阳医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36