用于病原体检测和治疗的工程化调理素制造技术

本发明专利技术提供了工程化分子调理素，所述工程化分子调理素可用于结合生物病原体或者识别亚类或特定病原体种，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中。本发明专利技术一方面提供了甘露糖结合凝集素（MBL），所述MBL为丰富的天然血清蛋白，是先天性免疫系统的一部分。这一蛋白凝集素结合至几乎所有种类生物病原体（病毒、细菌、真菌、原生动物）上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在诊断和治疗传染病和脓毒症中极其有用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分子免疫学、微生物病原体以及用于检测和/或移除流体(包括体液如血液)中的病原体的系统。更具体而言，例如，本专利技术提供了可用于结合生物病原体或者识别亚类(subclasses)或特定病原体种的工程化分子调理素，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中。
技术介绍
在美国，脓毒症是非冠状I⑶患者中的第二大主要死因，并且总的说来是第十大最常见死因。脓毒症是一种严重的医学症状，其以全身炎症性状态(称为全身性炎症应答综合征)和存在已知的或可疑的传染为特征。脓毒症一般在菌血症、病毒血症或真菌血症期间出现，并可能起因于由病原体(如金黄色葡萄球菌)所引起的传染，所述病原体不是典型的血源性病原体。血源性病原体是当通过血液或其它潜在已感染体液从受感染者转移至另一人时引发疾病的微生物。最常见的疾病包括乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、疟疾、丙型肝炎和梅毒。不幸地是，在通过血培养识别出传染物之前，全身性炎症应答综合征可变得危及生命。这一免疫应答引起急性期蛋白的普遍活化，影响了补体系统和凝集途径，然后，引起对脉管系统和器官的损害。各种神经内分泌逆调节系统(neuroendocrinecounter-regulatory systems )也得以活化,常常使得问题复杂化。即使是立即且强有力地进行治疗，其也可能发展至多器官功能障碍综合征并最终死亡。因此，仍然需要改进用于对患有传染病、血源性传染、脓毒症或全身性炎症应答综合征的患者进行诊断和治疗的技术。
技术实现思路
本专利技术提供了工程化分子调理素，所述工程化分子调理素可用于结合生物病原体或者识别亚类或特定病原体种，从而用于对患有传染病、血源性传染或脓毒症的患者进行治疗和诊断的装置和系统中，或用于对水源性病原体或食源性病原体进行鉴别。本专利技术一方面提供了甘露糖结合凝集素(MBL)，所述MBL为丰富的天然血清蛋白，是先天性免疫系统的一部分。这一蛋白凝集素结合至几乎所有种类生物病原体(病毒、细菌、真菌、原生动物)上的表面分子的能力使得工程化形式的MBL在诊断和治疗传染病和脓毒症中极其有用。本专利技术的实施方式提供了一种重组调理素，所述重组调理素包含调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至固体表面结合结构域的柔性肽结合域。在本专利技术的一些方面中，所述碳水化合物识别结构域为凝集素或凝集素的片段。或者，所述碳水化合物识别结构域为胶原凝集素或ficollin、或者它们的局部或片段。在特定的方面中，所述碳水化合物识别结构域(CRD)包含MBL的局部，所述局部起始于工程化调理素的凝集素部分的N末端的第81位脯氨酸残基。在另一特定的方面中，所述碳水化合物识别结构域包含MBL的局部，所述局部起始于工程化调理素的凝集素部分的N末端的第111位甘氨酸残基。在本专利技术的特定方面中，重组调理素的基底结合结构域包含一个或多个使其化学交联至固体基底的半胱氨酸残基。所述固体基底可包括磁性微珠(可包被有蛋白A)、微孔膜、中空纤维反应器或任何其它血液过滤膜或流动装置。在其它方面中，基底可以为细胞(如免疫细胞(例如，巨噬·细胞))的表面、在免疫系统的组织或器官(例如，淋巴结或脾)排列的细胞的表面、或者免疫系统的组织或器官的胞外基质的表面。在本专利技术的另一方面中，柔性肽结构域可包含至少一个甘氨酸+丝氨酸节段和/或至少一个脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段。在本专利技术的另一方面中，柔性接头为免疫球蛋白Fe部分，如Fe Y。人IgGlFc与MBL的颈区和CRD区的融合改进了表达和纯化以及以活化形式对基底的偶联。本专利技术的实施方式提供了一种从流体中收集结合调理素的微生物的方法，所述方法包括使缀合至固体表面的重组调理素与所述流体相接触；其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、固体基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述固体表面结合结构域的柔性肽结构域组成；使结合所述调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物；以及将所述微生物结合的重组调理素-固体表面缀合物与所述流体分离。所述流体可以是从受试者处得到的生物流体，如血液。然后，所述流体可返回至所述受试者。本专利技术的另一实施方式提供了一种对受试者的血液感染进行治疗的方法，所述方法包括向受试者的血液给予重组调理素，其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的柔性肽结构域组成，其中，所述碳水化合物识别结构域与结合调理素的微生物相结合，并且，其中所述基底结合结构域与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合；使所述重组调理素与结合调理素的微生物相结合；以及，使所述微生物结合的重组调理素与所述免疫系统的细胞、组织或器官相结合，所述微生物在所述免疫系统中被杀死。受试者可为动物或人。附图说明图I示出在本专利技术的实施方式中经工程化为成组的三聚体(聚合物)的甘露糖结合凝集素(MBL)的示意图。图2A和图2B为本专利技术实施方式的示意图，其中，人工蛋白(图2A)包含空间上不受阻的N-末端(任选在N-末端处或接近N-末端处具有半胱氨酸)、随后是以长的柔性肽节段、接着是处于C-末端的MBL凝集素结构域，所述人工蛋白交联至图2B中的示例装置中的固体基底。图3示出本专利技术实施方式的Fc-MBL. 81的草图形式以及基于Fe与MBL的颈区和碳水化合物识别结构域(CRD)的X射线晶体学模型的模型形式的图。图4为本专利技术的一个方面中编码Fe的载体的示意图。图5示出DynaBead-MBL对白色念珠菌(C. albicans)的I丐依赖性结合,其中，I丐维持结合而EDTA使结合不稳定。图6不出MBL-磁珠对不同病原体的结合。将病原体通过MBL包被的磁珠(对照无MBL的磁珠)结合、漂洗并洗脱至培养平板上。图7示出来自将MBL-磁珠结合至微生物并过夜培养试验的数据。将病原体通过MBL包被的磁珠(对照■ 无MBL的磁珠)结合、漂洗并洗脱至培养平板上，并孵育过夜。图8表明来自瞬时转染的FcMBL的高水平表达。图8A为用转染有pFUSEFc MBL. 81(和pFUSE Fe)的293细胞的未纯化上清液加样的、用抗_hFc进行探测的还原胶Western印迹。图8B示出Protein A纯化的Fe MBL. 81。图9示出耗竭试验(depletion assay)的结果，其中，在结合白色念珠菌(C. albicans)的方面，FcMBL. 81构建体的活性等同于全长的MBL。 具体实施例方式应当理解的是，本专利技术不限于本文所记载的具体的方法学、方案和试剂等，并因而可以进行变化。本文所使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方式，而并不打算限定本专利技术的范围，只通过权利要求书对本专利技术的范围进行限定。除非上下文明确地另有要求，如本文和权利要求书中所使用的单数术语应包含复数且复数术语应包含单数。除在操作实施例中或是另有指明以外，本文所使用的全部表达成分的量或反应条件的数值在所有实例中都应被理解为由术语“约”修饰。为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利和其它已确定的出版物在此明确地并入本文，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本专利技术相关。这些出版物仅因为它们的公开早于本专利技术的申请日而提供。在这方面的任何内容不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.19 US 61/296,2221.一种重组调理素，所述重组调理素包含 调理素的碳水化合物识别结构域； 基底结合结构域；以及 连接所述识别结构域至所述基底结合结构域的肽结构域。2.权利要求I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是胶原凝集素或fi Co 11 in、或者衍生自胶原凝集素或fi col I in。3.权利要求I中所述的重组调理素，其中，所述碳水化合物识别结构域是凝集素、或者凝集素的局部或片段。4.权利要求3中所述的重组调理素，其中，所述凝集素是甘露糖结合凝集素(MBL)。5.权利要求4中所述的重组调理素，其中，所述凝集素由MBL的第81位氨基酸残基(脯氨酸)至第228位氨基酸残基(异亮氨酸)(SEQID NO:2)组成。6.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底结合结构域包含至少一个使其化学交联至固体基底的半胱氨酸残基。7.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含甘氨酸+丝氨酸节段、或者脯氨酸+丙氨酸+丝氨酸节段。8.在先权利要求中任一项所述的重组调理素，其中，所述柔性肽包含免疫球蛋白Fe部分。9.权利要求8中所述的重组调理素，其中，所述Fe部分包括IgGFe结构域的CH2-CH3交界处。10.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底是磁性微珠、顺磁微珠、微孔膜、中空纤维反应器或任何其它流体滤膜或流动装置。11.在先任一项权利要求中所述的重组调理素，其中，所述基底是生物组织或器官的活细胞或胞外基质。12.权利要求11中所述的重组调理素，其中，所述基底是吞噬细胞。13.—种从流体中收集结合调理素的微生物的方法，所述方法包括 使缀合至固体表面的重组调理素与所述流体相接触；其中，所述重组调理素由调理素的碳水化合物识别结构域、固体基底结合结构域以及连接所述识别结构域至所述固体表面结合结构域的柔性肽结构域组成； 使所述结合调理素的微生物结合至所述重组调理素-固体表面缀合物；以及 将所述微生物结合的重组调理素-固体表面缀...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔·舒普尔，杰弗里·查尔斯·韦，唐纳德·E·英堡，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：
国别省市：