【技术实现步骤摘要】
技术介绍
1、已知通过序列特异性核酸酶的基因组编辑。参见参考文献1、2和3，通过引用将其全部内容结合于此。可以通过两种主要机制修复基因组中断裂的核酸酶介导的双链dna(dsdna)：非同源性末端接合(non-homologous end joining，nhej)，其通常导致引入非特异性的插入和缺失(插入缺失(indels))，或同源介导修复(hdr)，其引入作为修复模板的同源链。参见参考文献4，通过引用将其全部内容结合于此。当序列特异性核酸酶与包含所希望突变的同源供体dna构建体一同递送时，与仅单独的供体构建体相比，基因靶向效率增加了1000倍。参见参考文献5，通过引用将其全部内容结合于此。已经报告了将单链寡脱氧核糖核酸(“ssodn”)用作dna供体。参见参考文献21和22，通过引用将其全部内容结合于此。
2、尽管基因编辑工具上有较大进步，但是对于在人类诱导多能干细胞(“hipsc”)工程中使用定制设计的核酸酶存在许多挑战和问题。首先，尽管它们设计简化，但是转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effectors nucleases，talen)通过重复可变二残基(rvd)结构域的串联拷贝靶向特定的dna序列。参见参考文献6，通过引用将其全部内容结合于此。尽管rvd的模块化性质简化talen设计，但是它们的重复序列使用于合成它们的dna构建体的方法复杂化(参见参考文献2、9和15-19，通过引用将其全部内容结合于此)，而且削弱了它们伴随慢病毒基因递送载体的使用。参
3、在目前的实践中，通常使用独立的测定法评估nhej和hdr。往往使用错配敏感性核酸内切酶测定法(参见参考文献14，通过引用将其全部内容结合于此)测定nhej，但是该方法的定量准确度可变并且敏感度局限于nhej频率大于～3％。参见参考文献15，通过引用将其全部内容结合于此。通常通过克隆和测序评价hdr，克隆和测序是完全不同并往往是繁琐的程序。灵敏度仍是问题，因为通常针对诸如u2os和k562(参见参考文献12和14，通过引用将其全部内容结合于此)的某些细胞类型报告50％数量级的高编辑频率，但是hipsc中的频率一般较低。参见参考文献10，通过引用将其全部内容结合于此。近年来，报告了在hipsc和hesc中使用talen的高编辑频率(参见参考文献9，通过引用将其全部内容结合于此)，以及用crispr cas9-grna系统的甚至更高的频率(参见参考文献16-19，通过引用将其全部内容结合于此)。然而，不同位点处的编辑速率看起来变化广泛(参见参考文献17，通过引用将其全部内容结合于此)，并且在一些位点处的编辑有时根本不可检测(参见参考文献20，通过引用将其全部内容结合于此)。
4、细菌和古细菌(archaeal)crispr-cas系统凭借与cas蛋白的复合物中的短向导rna引导存在于侵略外源核酸内的互补序列的降解。参见deltcheva,e.et al.crispr rnamaturation by trans-encoded small rna and host factor rnase iii.nature 471,602-607(201 1)；gasiunas,g.,barrangou,r.,horvath,p.&siksnys,v.cas9-crrnaribonucleoprotein complex mediates specific dna cleavage for adaptiveimmunity in bacteria.proceedings of the national academy of sciences of theunited states of america 109,e2579-2586(2012)；jinek,m.et al.aprogrammabledual-rna-guided dna endonuclease in adaptive bacterialimmunity.science 337,816-821(2012)；sapranauskas,r.et al.the streptococcusthermophilus crispr/cas system provides immunity in escherichia coli.nucleicacids research 39,9275-9282(2011)；和bhaya,d.,davison,m.&barrangou,r.crispr-cas systems in bacteria and archaea:versatile small rnas for adaptive defenseand regulation.annual review of genetics 45,273-297(2011)。最近化脓性链球菌(s.pyogenes)ii型crispr系统的体外重构证实了融合至标准的反式编码tracrrna(“反式激活的crispr rna”)的crrna(“crispr rna”)足以引导cas9蛋白序列特异性裂解匹配crrna的靶dna序列。表达与靶位点同源的grna导致cas9的招募(recruitment)和靶dna的降解。参见h.deveau et al.,phage response to crispr-encoded resistance instreptococcus thermophilus.journal of bacteriology 190,1390(feb,2008)。
技术实现思路
1、本公开的方面涉及使用修饰的转录激活因子样效应物核酸酶(talen)用于基因修饰(改造，modify)细胞，诸如体细胞或干细胞。已知talen包含重复序列。本公开的方面涉及在细胞中改变靶dna的方法，包括将缺少100bp或更长重复序列的talen引入至细胞，其中，talen裂解靶dna并且细胞经历非同源性末端接合以在细胞中产生改变的dna。根据某些方面，已经从talen中除去了具有希望长度的重复序列。根据某些方面，talen缺乏具有某些希望长度的重复序列。根据某些方面，对talen提供了希望长度的重复序列的除去。根据某些方面，修饰talen以除去具有希望长度的重复序列。根据某些方面，工程化talen以除去具有希望长度的重复序列。
2、本公开的方面包括改变细胞中的靶dna的方法，包括在细胞内结合缺少100bp或更长重复序列的talen和供体核酸序列，其中，talen裂解靶dna并且将供体核酸序列插入至细胞中的dna。本公开的方面涉及包含编码缺少100bp或更长重复序列的talen的核酸序列的病毒。本公开的方面涉及包含编码缺少100bp或更长重复序列的talen的核酸序列的细胞。根据本文描述的某些方面，talen缺少100bp或更长、90bp或更长、80bp或更长、70bp或更长、60b本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种改变真核细胞中靶DNA的方法，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因靶向核酸酶是RNA-引导的基因靶向核酸酶，所述方法还包括给予所述真核细胞向导RNA，所述向导RNA含有所述靶DNA的靶序列的互补序列；
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述RNA-引导的基因靶向核酸酶含Cas9核酸酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因靶向核酸酶含转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述ssODN的长度为50至90nt。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述供体核酸序列包含相对于所述靶DNA的错配。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述供体核酸序列插入所述靶DNA之后，所述改变了的DNA中的所述错配距离所述靶位点至多40bp。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述供体核酸序列包含相对于所述靶DNA的其他错配。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述其他错配距离所述供体核酸序列中的所述错配至多30bp。
10.如权
11.如权利要求1所述的方法，其中，所述供体核酸序列经非同源性末端接合插入。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述真核细胞是动物细胞。
13.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因靶向核酸酶与所述ssODN同时引入所述真核细胞。
14.如权利要求1所述的方法，其中，在体外改变所述靶DNA。
15.如权利要求1所述的方法，还包括重复步骤(a)与(b)在所述细胞中形成多重外源核酸插入。
...【技术特征摘要】
1.一种改变真核细胞中靶dna的方法，包括：
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因靶向核酸酶是rna-引导的基因靶向核酸酶，所述方法还包括给予所述真核细胞向导rna，所述向导rna含有所述靶dna的靶序列的互补序列；
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述rna-引导的基因靶向核酸酶含cas9核酸酶。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述基因靶向核酸酶含转录激活因子样效应物核酸酶(talen)。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述ssodn的长度为50至90nt。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述供体核酸序列包含相对于所述靶dna的错配。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述供体核酸序列插入所述靶dna之后，所述改变了的dna中的所述错配距离所述靶位点...
【专利技术属性】
技术研发人员：乔治·M·丘奇，杨璐菡，马克·格尔·卡戈尔，乔伊斯·利奇·扬，
申请(专利权)人：哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：
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