【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体的涉及一种h5n8禽流感假病毒及其制备方法和应用。
技术介绍
1、禽流感是由甲型流感病毒引起的家禽类及野生鸟类呼吸系统疾病或致死性疾病的一种传染性疾病。根据其致病性分为高致病性、低致病性和无致病性。h5n8为高致病性禽流感，它是2010年在中国野鸭中首次发现的，之后世界多地发生了多起h5n8禽流感事件，造成数以万计的禽类死亡。在此前的研究中并未发现禽流感h5n8感染人类的报道。但是在2021年2月俄罗斯出现了首例h5n8感染人的事件，患者为7名家禽养殖工人，庆幸的是并未出现人传人的情况。但这再次为我们敲响警钟，由h5n8引起的疫情不容小觑，需要及时应对并加以防范。
2、就目前而言，面对高致病性禽流感h5n8感染人事例的出现，其相关药物、疫苗及抗体的研究也迫在眉睫，且尚无针对h5n8的特效药物，基于h5n8流感病毒的研究也很少被报道，而对于高致病性禽流感的研究只能在三级或四级实验室进行，极大地限制了对病毒的相关研究以及药物的开发。
3、对于高致病性禽流感的研究有严格的规范和要求，如果操作不当会造成病毒泄露甚至危及生命。对于活毒研究需要在安全资质高的实验室进行，即在三级或四级实验室进行，而三级实验室的建设复杂且成本高，数量少，很难获得相应的资质，极大地限制了对致病性禽流感的研究以及相关药物的研发。所以普通实验室存在无法利用高致病性活毒进行科学研究的限制。
4、因此，目前仍需要一种h5n8禽流感假病毒替代活毒。
技术实现思路
1
2、本专利技术的第一方面，提供一种制备h5n8亚型禽流感假病毒的方法，其包括以下步骤：
3、(1)分别使用编码重组ha蛋白、重组na蛋白的核酸构建真核重组表达质粒；
4、(2)使用转染试剂将所述包膜蛋白表达质粒与携带荧光素酶报告基因的骨架质粒共转染细胞，培养一段时间后换液继续培养，得到培养物；
5、(3)从所述培养物中分离得到假病毒。
6、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述真核重组表达质粒分别为pcdna3.1-ha和pcdna3.1-na，所述骨架质粒为pnl4-3.luc.r-e-质粒。
7、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，转染质粒的总量为1至3μg；转染试剂与质粒比例为1：1至4：1；骨架质粒与真核重组表达质粒的比例为1：1至4.5：1；含有编码重组ha蛋白的核酸的重组质粒与含有编码重组na蛋白的核酸的重组质粒比例为0.25：1至2：1；转染时间为4至20h；转染换液后培养时间为24至42h；包装细胞数量为7×105个/孔至9×105个/孔。
8、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述重组ha蛋白包括依次连接的启动子、ha信号肽、ha胞外区和his标签，所述重组na蛋白包括依次连接的启动子序列、人il-2信号肽、na胞外区和his标签。
9、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述ha胞外区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述ha信号肽的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述na胞外区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述人il-2信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
10、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述启动子的序列包括kozak序列，所述kozak序列为gccacc。
11、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述ha胞外区的启动子和所述his标签上均连接有酶切位点，所述na胞外区的启动子和所述his标签上均连接有酶切位点。
12、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，进一步包括(4)使用所述假病毒侵染靶细胞，培养一段时间后换液继续培养，进行清洗和裂解处理后，检测细胞裂解物的相对光单位。
13、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，侵染时间为8至24h；侵染换液后培养时间为36至66h；靶细胞数量4×103个/孔至9×103个/孔。
14、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的方法，其中，所述靶细胞为mdck细胞。
15、本专利技术的第二方面，提供一种h5n8亚型禽流感假病毒，其由骨架质粒、表达重组ha蛋白的质粒和表达重组na蛋白的质粒共转染细胞后得到，表达重组ha蛋白的质粒为pcdna3.1-ha，表达重组na蛋白的质粒pcdna3.1-na，所述骨架质粒为pnl4-3.luc.r-e-质粒。
16、本专利技术中，所述h5n8亚型禽流感假病毒包含骨架和包膜蛋白，所述包膜蛋白包括重组ha蛋白和重组na蛋白，所述重组ha蛋白包括依次连接的启动子、ha信号肽、ha胞外区和his标签，所述重组na蛋白包括依次连接的启动子序列、人il-2信号肽、na胞外区和his标签，所述ha胞外区的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述ha信号肽的氨基酸序列如seq idno.2所示，所述na胞外区的氨基酸序列如seq id no.3所示，所述人il-2信号肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
17、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的h5n8亚型禽流感假病毒，其中，所述启动子的序列包括kozak序列，所述kozak序列为gccacc。
18、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的h5n8亚型禽流感假病毒，其中，所述ha胞外区的启动子和所述his标签上均连接有酶切位点，所述na胞外区的启动子和所述his标签上均连接有酶切位点。
19、本专利技术的第三方面，提供一种药物组合物，其包含根据本专利技术所述的h5n8亚型禽流感假病毒。
20、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。
21、本专利技术的第四方面，提供一种筛选h5n8亚型禽流感病毒进入抑制剂的方法，其中，包括使用上述h5n8亚型禽流感假病毒侵染靶细胞的步骤。
22、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的筛选h5n8亚型禽流感病毒进入抑制剂的方法，其中，所述靶细胞为mdck细胞。
23、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的筛选h5n8亚型禽流感病毒进入抑制剂的方法，其中，所述方法包括使用所述假病毒侵染靶细胞，培养一段时间后换液继续培养，进行清洗和裂解处理后，检测细胞裂解物的相对光单位。
24、在某些实施方案中，根据本专利技术所述的筛选h5n8亚型禽流感病毒进入抑制剂的方法，其中，侵染时间为8至24h；侵染换液后培养时间为36至66h；靶细胞数量为4×103个/孔至9×103个/孔。
25、本专利技术的第五方面，提供根据本专利技术所述的h5n8亚型禽流感假病毒在用于制备预防或治疗禽流感病毒感染的药物组合物中的用途。
26、本专利技术解决了普通实验室无法利用高致病性活本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种制备H5N8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备H5N8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，所述真核重组包膜蛋白表达质粒分别为pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-NA，所述骨架质粒为pNL4-3.luc.R-E-质粒。
3.根据权利要求1或2所述的制备H5N8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，转染质粒的总量为1至3μg；转染试剂与质粒比例为1：1至4：1；骨架质粒与真核重组包膜蛋白表达质粒的比例为1：1至4.5：1；含有编码重组HA蛋白的核酸的重组质粒与含有编码重组NA蛋白的核酸的重组质粒比例为0.25：1至2：1；转染时间为4至20h；转染换液后培养时间为24至42h；包装细胞数量为7×105个/孔至9×105个/孔。
4.根据权利要求3所述的制备H5N8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，所述重组HA蛋白包括依次连接的启动子、HA信号肽、HA胞外区和His标签，所述重组NA蛋白包括依次连接的启动子序列、人IL-2信号肽、NA胞外区和His标签。
5.根据权利要求4所述
6.根据权利要求1所述的制备H5N8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，进一步包括(4)使用所述假病毒侵染靶细胞，培养一段时间后换液继续培养，进行清洗和裂解处理后，检测细胞裂解物的相对光单位；
7.一种H5N8亚型禽流感假病毒，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的制备方法得到。
8.一种药物组合物，其特征在于，其包含根据权利要求7所述的H5N8亚型禽流感假病毒；
9.一种筛选H5N8亚型禽流感病毒进入抑制剂的方法，其特征在于，其包括使用根据权利要求7所述的H5N8亚型禽流感假病毒侵染靶细胞的步骤；
10.根据权利要求7所述的H5N8亚型禽流感假病毒在用于制备预防或治疗禽流感病毒感染的药物组合物中的用途。
...【技术特征摘要】
1.一种制备h5n8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备h5n8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，所述真核重组包膜蛋白表达质粒分别为pcdna3.1-ha和pcdna3.1-na，所述骨架质粒为pnl4-3.luc.r-e-质粒。
3.根据权利要求1或2所述的制备h5n8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，转染质粒的总量为1至3μg；转染试剂与质粒比例为1：1至4：1；骨架质粒与真核重组包膜蛋白表达质粒的比例为1：1至4.5：1；含有编码重组ha蛋白的核酸的重组质粒与含有编码重组na蛋白的核酸的重组质粒比例为0.25：1至2：1；转染时间为4至20h；转染换液后培养时间为24至42h；包装细胞数量为7×105个/孔至9×105个/孔。
4.根据权利要求3所述的制备h5n8亚型禽流感假病毒的方法，其特征在于，所述重组ha蛋白包括依次连接的启动子、ha信号肽、ha胞外区和his标签，所述重组na蛋白包括依次连接的启动子序列、人il-2信号肽、na胞外区和his标签。
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【专利技术属性】
技术研发人员：于飞，李延柏，霍珊珊，唐雅清，刘朋，豆豆，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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