抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗家畜和水产病原体的特异性ＩｇＹ或复合ＩｇＹ，其特征在于，该ＩｇＹ是选自抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性ＩｇＹ、抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性ＩｇＹ、抗水产致病菌特异性复合ＩｇＹ、抗水产真菌特异性复合ＩｇＹ、抗水产病毒特异性复合ＩｇＹ、抗呼肠孤病毒特异性ＩｇＹ、抗鱼疱疹病毒抗原特异性ＩｇＹ、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性ＩｇＹ和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性ＩｇＹ中的一种或一种以上的组合。本发明专利技术还涉及该抗家畜和水产病原体的特异性ＩｇＹ或复合ＩｇＹ的制备方法，以及该特异性ＩｇＹ或复合ＩｇＹ在注射剂、浸浴剂、饲料添加剂以及预配料中的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽医领域，具体涉及一种抗家畜和水产病原体特异性IgY或复合IgY以及这种IgY在饲料添加剂和预配剂等中的应用。
技术介绍
对于家畜中经常发生的感染性疾病，如感染性胃肠炎、流行性腹泻等，水产中经常发生的烂鳃病、肠炎病、烂尾病、细菌性败血症等，目前世界各地基本上主要采用抗生素和各种化学杀菌剂来防治。但是，一方面，家畜和鱼类中许多感染性疾病是由病毒引起的，抗生素对病毒是没有作用的；另一方面，全球都关注抗生素和化学药的残留问题，它会污染肉、鱼、蛋、奶等产品以及环境，危害人类健康；而且，滥用抗生素，还会诱发病菌发生变异，产生耐药菌，增加对这些疾病的治疗难度。开发一种安全有效的防治这样常见家畜和水产品感染性疾病的新方法，寻找既无药残，又无污染，又能提高饲養经济效益的抗生素替代品，成为摆在世界各国畜产、水产科学家和畜医学界的重要课题。也有学者试图从猪的粪便中分离出一种大肠杆菌、一种传染性胃肠炎病毒、一种流行性腹泻病毒和轮状病毒，培飬后制作疫苗，用其免疫鸡，直接就采用母鸡卵黄干燥后作食品添加剂。由于引致猪腹泻的病菌除了大肠杆菌外，尚有魏氏梭菌和猪链球菌，而大肠杆菌、魏氏梭菌和猪链球菌又有几十种不同的型。引起传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒也有许多不同种型，而且经常发生变异。另外，未经提取的卵黄仅含有少量抗体成份，抗体活性很低，而且还含有许多脂蛋白和杂蛋白，直接用于治疗猪腹泻等疾病，效果成疑。因此，采用常规的方法所制成的认为可防治猪腹泻的仅可能对付个别细菌或病毒的、低活性的卵黄粉，对于种型繁多的顽固的致病菌及经常变异的病毒是难以真正达到实际效果的。专利技术内容针对现有技术的上叙缺陷，本专利技术的目的是提供一种抗家畜和水产病原体的特异性IgY或复合IgY，通过对大肠杆菌、魏氏梭菌、链球菌菌株和病毒抗原的特殊处理方法以及采用基因工程重组传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒表达蛋白，提高其抗原性；并采用纯水提取IgY的工艺和纳米技术等方法，以增强所制备的卵黄免疫球蛋白的实际疗效。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的1.筛选引致家畜和水产感染性疾病的主要病原体，并根据这些有代表性的病原体的「抗原交叉性」进行分类组合。1.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻1.1.1细菌类1.1.1.1肠毒性大肠埃希氏菌1.1.1.2 C型魏氏梭菌菌株1.1.1.3猪链球菌1.1.2病毒类1.1.2.1猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)1.1.2.2猪流行性腹泻病毒(PEDV)1.1.2.3猪轮状病毒(HRV)1.2水产类主要感染病原体 1.2.1细菌类1.2.1.1柱状嗜纤维菌1.2.1.2嗜水气单胞菌1.2.1.3气单胞菌1.2.1.4孤菌1.2.2真菌类1.2.2.1水霉菌1.2.2.2绵霉菌1.2.2.3丝囊霉菌1.2.2.4鳃霉菌1.2.3病毒类1.2.3.1呼肠孤病毒1.2.3.2鱼疱疹病毒1.3牛传染性胃肠炎和流行性腹泻1.3.1细菌类1.3.1.1牛肠毒性大肠埃希氏菌1.3.1.2 B型魏氏梭菌菌株1.3.2病毒类1.3.2.1牛传染性胃肠炎病毒(TGEV)1.3.2.2牛流行性腹泻病毒(PEDV)1.3.2.3牛轮状病毒(HRV)2.在筛选和分类组合各种家畜、水产类感染性疾病病原体的基础上，分别制备多种复合抗原 2.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻两种抗原2.1.1猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌复合抗原2.1.2制备致病菌抗原成份由于大肠杆菌型种太多，简单地用一种大肠杆菌免疫母鸡所制成的卵黄抗体对大多数大肠杆菌是无效的。针对这一难题，本专利技术采取以下两个方法解决2.1.2.1细菌超声粉碎，增加抗原性向美国病毒中心(ATCC)购买肠毒性大肠埃希氏菌(ATCC#51659)、C型魏氏梭菌(ATCC#12917)、猪链球菌(ATCC#700794)标准菌株按照肠毒性大肠埃希氏菌C型魏氏梭菌以及猪链球菌的培养特性和最适培养条件，分别选择适宜的培养基，进行菌株大量繁殖，收集培养物，提纯、分装；然后将肠毒性大肠埃希氏菌、C型魏氏梭菌、猪链球菌三种细菌按1∶1∶1的比例混合，再采用超声粉碎机将所培飬的大肠杆菌等粉碎，获得含全菌和菌体成份的混合物。2.1.2.2用猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛作为抗原成份委托新加坡国立大学培飬猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛。由于这两种纤毛对是大多数大肠杆菌都具有抗原性；将其作为抗原成份，就可解决大肠杆菌型种繁复的难题。2.1.3制作致病菌抗原同样，采取两种不同方法2.1.3.1菌体抗原制作把超声粉碎后所得到的大肠杆菌等的全菌和菌体成份混合物按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌菌体组合复合抗原。2.1.3.2杆菌纤毛抗原制作将培飬好的猪大肠杆菌k88、k99两种纤毛混合先按1∶1比例混合均匀后按1-10∶10-1的比例加入福氏佐剂，再置入高速匀浆机中，以30,000rpm高速粉碎匀化，形成油包水溶液，制得传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌纤毛组合复合抗原。2.1.4猪传染性胃肠炎和流行性腹泻病毒复合抗原2.1.4.1本专利技术采用二种方法制作病毒抗原成份。2.4.1.1.1病毒裂解法向美国病毒中心(ATCC)购买猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)-(ATCC#VR-743)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)-(ATCC#VR-669)以及猪轮状病毒(ATCC#VR-892)等三种病毒之标准毒株，采用常规方法增殖培飬，再提纯。将所增殖并提纯的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪轮状病毒按1-10∶1-10∶1-10的比例混合，然后加入十二烷基硫酸钠(SDS)，最终浓度为1.8-2.5％，裂解30分钟，即分别得到猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)以及猪轮状病毒组合的病毒裂解液。经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)检验分析，浓缩胶4％，分离胶7％，240V，电泳30分钟。考玛氏亮蓝染色，观察蛋白带。2.1.4.1.2采用基因工程重组技术分别制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的表达蛋白，具体步骤如下 2.1.4.1.2.1制备猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)表达蛋白用RT-PCR方法从猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)之RNA克隆基因去掉信号肽和穿膜区的片段。先插入pGEM-T裁体。测序证明所获得的基因序列正确后，用限制性内切酶EcoR I和Not I双酶消化，电泳回收目的片段，与用同样双酶消化的酵母表达裁体pPIC9K连接。转化大肠杆菌。挑取阳性克隆，提质粒，酶切鉴定正确后，电转化毕氏酵母菌(Pichiapastoris)KM71和GS115。在不含组氨酸的培养基上筛选阳性克隆，然后再在含不同浓度的G418的培养基上筛选高拷贝转化株。挑取单个菌落接种到培养基中，在28度摇床培养过夜。稀释后继续培养。待细菌浓度达到OD600的吸光值约为0.8时，将培养基换成含甲醇的培养基，继续培养24-48小时。于培养的不同时间采样，用ELISA法测定表达量。选表达量最高的时间收获。离心去除细胞沉淀。上清中即含大量表达产物。经硫酸铵沉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗家畜和水产病原体的特异性ＩｇＹ或复合ＩｇＹ，其特征在于，该ＩｇＹ是选自抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性ＩｇＹ、抗猪传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性ＩｇＹ、抗水产致病菌特异性复合ＩｇＹ、抗水产真菌特异性复合ＩｇＹ、抗水产病毒特异性复合ＩｇＹ、抗呼肠孤病毒特异性ＩｇＹ、抗鱼疱疹病毒抗原特异性ＩｇＹ、抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻致病菌特异性ＩｇＹ和抗牛传染性胃肠炎和流行性腹泻的病毒特异性ＩｇＹ中的一种或一种以上的组合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：包晟，王长安，蔡婷英，谢彦博，
申请(专利权)人：雅臣药业集团远东有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]