本发明专利技术涉及人红细胞缺乏症如贫血等疾病的治疗药物。具体的，本发明专利技术提供一种用于治疗人各种类型贫血的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有促红细胞生成素模拟肽(EMP-1)和人IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或IgG2-Fc突变体(T250Q/M428L；T307Q/N434A；N434S)，能有效改善贫血患者的生存状况，同时增加EMP-1体内的半衰期，尤其是EMP-1与IgG-Fc(T250Q/M428L；T307Q/N434A；N434S)突变体融合蛋白，增强与FcRn亲和力，进一步增加EMP-1的体内半衰期。通过体内和体外的活性试验证实本发明专利技术的融合蛋白及突变体具有较好的生物活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及人红细胞缺乏症如贫血等疾病的治疗药物。具体的，本专利技术提供一种用于治疗人各种类型贫血的融合蛋白及其制备方法和应用。所述融合蛋白含有促红细胞生成素模拟肽(EMP-I)和人 IgG2-Fc(铰链区-CH2-CH3)或 IgG2_Fc 突变体(T250Q/M428L ； T307Q/N434A ；N434S)，能有效改善贫血患者的生存状况，同时增加EMP-I体内的半衰期，尤其是 EMP-I 与 IgG-Fc (T250Q/M428L ；T307Q/N434A ；N434S)突变体融合蛋白，增强与 FcRn 亲和力，进一步增加EMP-I的体内半衰期。
技术介绍
促红细胞生成素(EPO)是由165个氨基酸和4个糖链组成的糖蛋白激素，通过特异结合红血球前体细胞表面上的特异性的受体，发挥红细胞生成的主要调节剂作用。此过程能够发出它们增殖和向成熟的红细胞分化的信号。促红细胞生成素受体是对促红细胞生成素具有高亲和力的484-氨基酸糖蛋白(Anna-Leena Sir6n等,Acta Neuropathologica, 1996(101)，271-276)。对于促红细胞生成素受体来说，配体诱发的同二聚体化作用是控制活化的关键因素。健康的哺乳动物体内血浆中EPO的浓度非常低，正常情况下现有循环数目的红细胞足以满足组织对养料的需求。EPO的存在会刺激新的红细胞的生成，以替代在老化过程中损失的那些红细胞(Iain C Macdougall 等人，Kidney International, 1996 (50), 1694-1699)。但是，某些疾病状态经常出现异常的红细胞生成。在许多国家，使用重组人 EPO(rHuEPO)治疗红细胞减少的各类贫血性疾病。美国食品和药品管理局(U. S. Food and Drug Administration ；FDA)已经批准了重组人EPO在治疗末期肾病有关的贫血中的用途。 接受血液透析来治疗肾病相关贫血患者一般患有严重的贫血，后者作为透析治疗的结果， 由红细胞的破裂和过早死亡造成。EPO也用于治疗其它类型的贫血。例如，可以用EPO治疗化疗诱发的贫血、与脊髓发育不良有关的贫血、与各种先天性障碍有关的贫血、AIDS-有关的贫血和早熟-有关的贫血。另外，EPO可以在其它的领域起作用，例如在骨髓移植患者、 准备自体输血的患者和患有铁过载障碍的患者中帮助更迅速地恢复正常的血细胞比容。促红细胞生成素具有相对较短的半衰期。在患有慢性肾功能衰竭(CRF)的患者中，体内半衰期大约为3 4小时。在治疗剂量范围内，可检测水平的血浆促红细胞生成素能维持至少24小时。皮下施用促红细胞生成素后，在5 24小时内达到峰值血清水平，此后缓慢下降。因此，需要提供改善的和/或修饰形式的EPO治疗蛋白，其能克服这些问题和本领域已知的其它问题。促红细胞生成素(EPO)是调控红细胞生长的红细胞特异生长因子，EPO受体 (EPOR)属于造血生长因子受体超家族成员，这一家族缺乏胞内激酶活性。寻找EPO受体肽配体的研究最初与IL-IR相同，将可溶性受体蛋白固定于抗体基质上，通过筛选随机的噬菌体展示肽文库对促红细胞生成素受体的亲和力，几个研究组鉴别出了促红细胞生成素的小肽模仿物(Peptidomimetics)。得到单一的环八肽序列RIGPITWC,可竞争EPO与EPO受体的结合，IC50为10 μ mol/L。以此作为前导肽构建限制性文库，筛选得到与ERO受体特异结合的肽配体，这些肽含有高度保守的核心序列GPLTW和成对的半胱氨酸；另外，在二硫桥外还发现有一高度保守的Y残基，此Y残基在短肽活化受体时有很重要的作用。化学合成一组与核心序列最为匹配的肽，它们能够与EPO竞争结合EPO受体，其IC50为O. 2 I μ mol/ L，活性提高了 10 50倍。这些序列与促红细胞生成素没有同源性。在功能测定中，这些肽中的几种表现出了活性，但仅是重组促红细胞生成素的活性的1/100，000。尽管已经通过制备肽模仿物的共价二聚体或多聚体，进行了提高这些肽的效力的几种尝试，但在摩尔基础上，这些化合物仍然是促红细胞生成素的活性的1/10，000 1/1，000，且具有非常短的半衰期，这使得它们不适用作治疗剂(US patent7393662完全引述作为参考)。FDGR-I是IL_3依赖的鼠髓源单核细胞系，有完整的造血生长因子信号传导通路， 用转染人全长EPO受体的FDGR-I细胞(YDGR-IhEPOR)评价对结合肽的生物学活性。单独用肽刺激FDGR-IhEPOR显示有与EPO同样的增殖效应；蛋白酪氨酸磷酸化和细胞周期动力学检测发现此类肽与EPO的效应相同。结果表明，用噬菌体肽库筛选得到了具有EPO激动剂效应的肽配体GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG，被命名为“ΕΡ0模拟肽(EMPl) ”具有较高的EPO受体激动活性(US19960641071完全引述作为参考)。通过EMPl人们得到了高质量的EPO受体的晶体结构，为EPO和EPO受体的结构与功能关系提供了重要信息，X射线衍射分析表明，EMPl可以二聚化，并导致EPO受体二聚化。 通过Lys- β -Ala 二肽桥可以形成EMPl的对称二聚体，在探讨肽二聚体的生物学活性时，发现正确形成二硫键的EMPl 二聚体有更为明显的细胞增殖效应，其EC50值为2nmol/L，比单分子(EC50值为200nmol/L)提高了 100倍；体内实验也说明二聚体分子的活性有所增强。 鼠缺氧红细胞增多生物检测实验表明，双体比单体的活性高出100倍；采用聚乙二醇(PEG) 进行EMPl的N端二聚化则可使其作为激动剂的体内外活性提高10 1000倍(Kathryn W. Woodburn 等人，Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 104,155 163)。人EMPl具有短的体内半衰期。在小鼠中，人EMPl的半衰期为I 2小时。在开发红细胞缺乏类疾病如贫血等的治疗药物中，用作治疗的EMP-I多肽，可能需要延长在体内的半衰期。具有延长半衰期的EMP-I多肽可允许较低频率给予患者药物注射。因此，如何在不影响EMP-I生物活性的同时增加在体内的半衰期，是众多科学家研究的焦点。如 US patent2004/028976 或 US patent2007/0275871 中描述的 EMP-I 融合 IgG-Fc,能明显的增强其在体内的半衰期。半衰期延长是由于Fe与FcRn的结合，使IgG获得了保护，同时增加在体内的循环时间，已经在美国进入I期临床研究(P. J. Bugelski等人，Journal of Biotechnology. 2008 (134) 171-180)。此外，Affymax和百时美施贵宝公司联合开发的聚乙二醇化的EMPl (商品名Hematide)已经顺利进入美国的III期临床研究(Kathryn W. Woodburn 等人，Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 104,155-163)。这使得人们进行更多努力以研究基于EMPl肽在体内功效稳定且长效药本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种融合蛋白，由促红细胞生成素模拟肽(erythropoietin？mimetic？peptides，EMP)通过连接肽(Linker)与IgG？Fc或IgG？Fc突变体形成，其通式为EMP？Linker？IgG？Fc或者IgG？Fc？Linker？EMP。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张海涛，
申请(专利权)人：张海涛，
类型：发明
国别省市：
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