本发明专利技术涉及一种基于环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术的食源性病原体快速检测技术。一种变形杆菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为变形杆菌的ｕｒｅＲ－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｚ１８７５２，所述引物与所述靶基因的５８６位－８１０位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明专利技术通过提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在变形杆菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在变形杆菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对变形杆 菌特定基因片段具有特异性的引物及引物组；还涉及将所述引物及引物组用环介导等温扩 增法检测变形杆菌的检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌TO72H序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号W0 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测变形杆菌的检测方法和检测试剂盒，以及对变形杆菌特定基因片段具有特异性的 LAMP引物组的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物。上述目的是通过如下技术方案实现的一种变形杆菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基 因为变形杆菌的ureR-—GenBank登陆号Z18752，所述引物与所述靶基因的586位-—810 位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本专利技术的另一个目的在于，提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组。上述目的是通过如下技术方案实现的一种变形杆菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3-ure GGTGAGATTTGTATTAATGGGC反向外引物B3-ure ATAATCTGGAAGATGACGAGTA正向内引物FlP-ureTGTCACATCACAAGAAACTTGACTAAAACTATCACAGTCACCACTA 反向内引物 BIP-ureTTCCCGACCAAACCGATTGAATTATAATGGTTTGAGTAAAGAGAACAC 可以扩增变形杆菌的 ureR(Z18752)基因序列的586位-—810位的核酸序列的一部分或其互补链。本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组的基于环介导等温扩增法检 测变形杆菌的检测方法。上述目的是通过如下技术方案实现的一种变形杆菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在变形杆菌，其特征在 于，以变形杆菌的ureR(Z18752)基因序列的586位一810位的核酸序列的一部分或其互 补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否存在有扩增产物。具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA;2)变形杆菌的环介导等温扩增(LAMP)取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶。反应体系为(反应总体积20ul IOOul) 3) LAMP反应产物的检测A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；或，B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000XSYBR Green I (invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在160bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测 变形杆菌的检测试剂盒。上述目的是通过如下技术方案实现的一种变形杆菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述引物组 的扩增反应液、酶。所述扩增反应液中包括如下试剂 其中 lOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM pH8. 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-Hcl)、100mM氯化钾、lOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；所述酶为每微升含8个活性单位的Bst DNA酶。所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为奇异变形杆菌基因组DNA (1 IOOnM)。本专利技术通过提供一种对变形杆菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含 有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在变形杆菌特定基因片段，进而确定标本中是否 存在变形杆菌。本专利技术检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、方便快捷、不需特殊 仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层普及应用难题；特别 是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性强、敏感性比PCR高 或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即可完成)等优点。附图说明图1本专利技术所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后可通过肉眼观察的结果；图 例1、阳性扩增结果；2、阴性扩增结果。图2本专利技术所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后加入染料观察的结果；图 例1、阴性扩增结果；2，3、阳性扩增结果。图3本专利技术所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)结果的电泳图；图中，1 =IOObp marker ；2 奇异变形杆菌；3_14分别为金黄色葡萄球菌、金黄色葡 萄球菌产肠毒素A菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素B菌株、金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌 株、鼠伤寒沙门氏菌、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种变形杆菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为变形杆菌的ｕｒｅＲ－－－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｚ１８７５２，所述引物与所述靶基因的５８６位－－－８１０位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏泉德，张彩虹，谭爱军，张丽荣，
申请(专利权)人：珠海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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