本发明专利技术涉及一种基于环介导等温扩增（ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）技术的食源性病原体快速检测技术。一种金黄色葡萄球菌检测用引物，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为金黄色葡萄球菌的ｎｕｃ－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｖ０１２８１，所述引物与所述靶基因的５４８位－７９５位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本发明专利技术通过提供一种对金黄色葡萄球菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在金黄色葡萄球菌特定基因片段，进而确定标本中是否存在金黄色葡萄球菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技术的食源性病原体快速检测技术。特别涉及对金黄色 葡萄球菌特定基因片段具有特异性的引物组；还涉及将所述引物组用环介导等温扩增法检 测金黄色葡萄球菌的检测方法和检测试剂盒。
技术介绍
食源性疾病发病率较高，由沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，变形杆菌，霍乱 弧菌，副溶血性弧菌以及E.coli 0157:H7，轮状病毒以及诺如病毒引起的食物中毒，其发病 率在我国食源性疾病发病率中占非常高的比例，是一个严重的公共卫生问题。目前对食源性病原体的检测主要依靠病原体分离法、免疫学方法和各种PCR方 法。病原体分离虽然是金标准，但繁琐费时，一般需要5天时间，最长需要一个月时间，而且 免疫学方法的特异性和敏感性均较低。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如PCR中 国专利公开号CN1526825的专利申请，批露了一种利用副溶血性弧菌TO72H序列的特异性， 通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测副溶血性弧菌的方法。虽然该方 法敏感、准确、快速，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技 术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)技术(国际 专利公开号W0 00/28082)是2000年Notomi等开发出一种核酸扩增新技术，即针对靶基因 的6个区域设计4条特异引物(如有需要还可以添加有环引物对)，利用一种链置换DNA聚 合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应， 扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也 可用结合双链DNA的荧光染料SYBR Green I染色，通过肉眼进行判定。用于LAMP技术扩 增的2对引物乃针对基因6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循 环、其单位时间内扩增效率更高、且不需特殊仪器等优点。但是目前未有利用环介导等温扩 增法检测金黄色葡萄球菌的检测方法和检测试剂盒，以及对金黄色葡萄球菌特定基因片段 具有特异性的LAMP引物及引物组的报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供一种对金黄色葡萄球菌特定基因片段具有特异性的 引物。上述目的是通过如下技术方案实现的一种金黄色葡萄球菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所 述靶基因为金黄色葡萄球菌的nuc—GenBank登陆号V01281，所述引物与所述靶基因的 548位一795位的核酸序列的一部分或其互补链互补。本专利技术的另一个目的在于，提供一种对金黄色葡萄球菌特定基因片段具有特异性的引物组。上述目的是通过如下技术方案实现的一种金黄色葡萄球菌检测用引物组，其特征在于，所述引物组由下列引物组成正向外引物F3-nuc GTCAACCAATGACATTCAGAC反向外引物B3-nuc AACTTTAGCCAAGCCTTGA正向内引物FIP-nuc ATGCACTTGCTTCAGGACCACACCTGAAACAAAGCATCC反向内引物BIP-nucGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAACGTTTACCATTTTTCCATCAGC可以扩增金黄色葡萄球菌的nuc(V01281)基因序列的548位-—795位的核酸序 列的一部分或其互补链。本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物组基于环介导等温扩增法检测 金黄色葡萄球菌的检测方法。上述目的是通过如下技术方案实现的一种金黄色葡萄球菌的检测方法，该方法用于检测标本中是否存在金黄色葡萄球 菌，其特征在于，以金黄色葡萄球菌的nuc(V01281)基因序列的548位一795位的核酸序 列的一部分或其互补链为靶，通过LAMP法用上述引物组选择性扩增上述靶区域，确认是否 存在有扩增产物。具体检测方法为1)样品处理和模板提取，样品范围适用于食品样品、粪便、呕吐物等标本；细菌待 检标本用相应肠道增菌液增菌培养8-12小时后，取1. Oml增菌液IOOOOrpm离心2分钟，弃 其上清液后，用DNA提取试剂盒提取模板DNA或加20 30ul三蒸水煮沸5分钟，再取2ul 上清液做待检模板DNA;2)金黄色葡萄球菌的环介导等温扩增(LAMP)取扩增反应液，先加待检模板，再加酶，最后加双蒸水，形成如下总体积为20ul IOOul的反应体系，混勻点离后在约60-65°C条件下恒温保温约60-90分钟，然后置于80°C 的环境下2分钟灭活酶。反应体系为(反应总体积20ul IOOul)Γ^终浓度或量待检模板~~核酸模板1-IOul正向内引物 FIP-nuc1.0-2. OuM反向内引物 BIP-nuc1.0-2. OuM正向外引物 F3-nuc0. 15-0. 3uM扩反向外引物B3-nuc0.15-0. 3uM增甜菜碱 betaine0. 8-1. 5M反dNTP1. 0-1. 6mM应mgs042液 3) LAMP反应产物的检测A)肉眼检测与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为 阴性；或，B)加染料后检测每25ul体系的反应管加1000 X SYBR Green I (Invitrogen) l_2ul，1-5分钟观察结果，反应液变绿为阳性，保持无色或棕色为阴性；或，C)电泳检测2_3%琼脂糖凝胶，70V电泳约60-100分钟，电泳图片显示LAMP特征 性梯状条带，最小片段在190bp左右，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。本专利技术的另一个目的在于，提供一种利用上述引物或引物组基于环介导等温扩增 法检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒。上述目的是通过如下技术方案实现的一种金黄色葡萄球菌检测用试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少包括含有上述 引物或引物组的扩增反应液、酶。所述扩增反应液中包括如下试剂 其中IOXBst DNA Polymerase Buffer 反应缓冲液含有 200mM ρΗ8· 8 的三羟基 甲硫氨酸甲烷-盐酸(Tris-HCl) UOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20Mm硫酸镁和曲拉通 X-100 ；所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA酶。所述试剂盒还包括阴性及阳性对照模板，所述阴性对照模板为双蒸水；所述阳性对照模板为金黄色葡萄球菌基因组DNA (1 IOOnM)。本专利技术通过提供一种对金黄色葡萄球菌特定基因片段具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测标本中是否存在金黄色葡萄球菌特定基因片段，进而确 定标本中是否存在金黄色葡萄球菌。本专利技术检测试剂和检测方法具有敏感性高、特异性强、 方便快捷、不需特殊仪器、适用范围广等优点，可解决食源性病原体的现场快速检测和基层 普及应用难题；特别是现场检测及战时野外应用。同时，与现有的PCR方法相比具有特异性 强、敏感性比PCR高或相当、比PCR省时约2小时、不需特殊仪器(扩增反应在水浴锅中即 可完成)等优点。附图说明图1本专利技术所述引物组进行环介导等温扩增(LAMP)后可通过肉眼观察的结果。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种金黄色葡萄球菌检测用引物，其特征在于，能扩增靶基因的特异碱基序列，所述靶基因为金黄色葡萄球菌的ｎｕｃ－－－ＧｅｎＢａｎｋ登陆号：Ｖ０１２８１，所述引物与所述靶基因的５４８位－－－７９５位的核酸序列的一部分或其互补链互补。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：魏泉德，张彩虹，谭爱军，张丽荣，
申请(专利权)人：珠海市疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：44[中国|广东]
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