不含衣壳的AAV载体、组合物以及制备载体和基因递送的方法技术

一种分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸和第二AAV?ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。所述核酸分子可以重复应用于宿主而不引发免疫应答。还提供制备和纯化这种核酸分子的方法以及这种核酸分子用于治疗目的的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】一种分离的线性核酸分子，其以这样的顺序包含：第一腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、感兴趣的核苷酸和第二AAV?ITR，其中所述核酸分子没有AAV衣壳蛋白编码序列。所述核酸分子可以重复应用于宿主而不引发免疫应答。还提供制备和纯化这种核酸分子的方法以及这种核酸分子用于治疗目的的用途。【专利说明】不含衣壳的AAV载体、组合物以及制备载体和基因递送的方法
本专利技术涉及将外源的，特别是异源的DNA序列递送至靶标，特别是靶细胞、组织、器官或生物体的方法。具体地，本专利技术涉及用于将异源DNA序列递送至靶标的新的没有病毒衣壳蛋白的裸腺伴随病毒(AAV)载体(此后“AAV0” )。本专利技术的重组AAVO载体可以用于将外源DNA序列体外、离体或体内递送至靶标。本专利技术还提供制备和纯化AAVO载体的方法。
技术介绍
基因治疗的目的是纠正有缺陷的基因，所述有缺陷的基因构成疾病发展的基础。解决这个问题的常见方法包括将正常基因递送至细胞核。这个基因然后可以插入靶细胞的基因组，或者可以保持游离。将矫正基因递送至对象的靶细胞可以通过许多方法进行，包括使用病毒载体。在许多可用的病毒载体中(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒等)，腺伴随病毒(AAV)作为多功能载体在基因治疗中越来越受欢迎。腺伴随病毒(AAV)是细小病毒家族的成员。AAV基因组由线性单链DNA分子组成，其包含约4.7千碱基(kb)，并且由编码非结构性R印(复制)和结构性Cap (衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框组成。AAV编码区的侧翼是两个起顺式作用的核苷酸反向末端重复(ITR)序列，长度为约145个核苷酸，具有可以折叠为发夹结构的中断的回文序列，在DNA复制起始期间作为引物发挥功能。除了它们在DNA复制中的作用，据证实ITR序列是病毒整合、从宿主基因组拯救以及病毒核酸衣壳化为成熟病毒粒子所必需的(Muzyczka，(1992)Curr.Top.Micr0.Tmmunol.158:97-129)。来源于AAV的载体对于递送遗传物质特别有吸引力，这是因为:⑴它们能够感染(转导)各种非分裂和分裂细胞类型，包括肌肉纤维和神经元；(ii)它们没有病毒结构基因，从而消除了对病毒感染的天然宿主细胞应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒从未与人的任何病理关联；(iv)与能够整合入宿主细胞基因组的野生型AAV相比，复制缺陷的AAV载体一般保持游离，因此限制插入诱变或激活癌基因的风险；以及(V)与其他载体系统相比，AAV载体不触发显著的免疫应答(见ii)，因此允许治疗性转基因的长期表达(只要它们的基因产物未被排斥)。还可以以高滴度制备AAV载体，并且至少在啮齿动物中，动脉内、静脉内或腹腔内注射允许基因通过单次注射转移至显著的肌肉区域(Goyenvalleet al., 2004;Fougerousse et al., 2007;Koppanati et al., 2010;Wang et al.，2009)。关于递送遗传物质，与质粒DNA相比，AAV载体还具有多个优势。例如，从质粒表达异源基因是短期的，质粒通常具有较大的大小，并且质粒需要物理操作以递送入细胞(例如，显微注射、转染、电穿 孔)。此外，基因如肌养蛋白的质粒转移引发宿主的免疫应答并且与低效率相关(Romero et al., 2004)。但是，使用常规AAV作为基因递送载体也有许多缺点。首先，这种治疗的大部分潜在接受者已经对给定类型的AAV载体是血清反应阳性的(Boutin et al.，2010)。第二，在一些对象中，AAV载体可以引发温和的宿主免疫应答，这可能是由病毒衣壳或加工杂质引发的。在这种情况下，使用免疫抑制剂控制免疫应答仅为临时措施，因为一旦对象脱离这些免疫抑制剂，免疫应答复发(Lorain et al.，2008)。可能与AAV相关的主要缺点是其有限的病毒包装能力，仅为约 4.5kb异源DNA (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Laiet al., 2010)。使用双载体策略的不同方法试图扩大AAV载体包装能力，例如设计为向靶细胞递送大治疗基因的反式剪接(ts)和重叠(Ov)AAV载体系统。例如，Lostal等人通过在外显子28/29连接处分拆dysferlin cDNA并将其克隆入两个独立的携带适当剪接序列的AAV载体来绕过关于dysferlin cDNA的大小限制,所述限制使得dysferlin cDNA不可以直接整合入AAV载体用于基因转移至肌肉。然而，即使这些方法仍有固有的效率低下。因此，小的包装能力仍是AAV基因治疗中的主要限制。尚未考虑去除衣壳(通过这种方式可以克服包装能力)，因为据认为衣壳对于允许载体进入细胞是必要的。另一显著的缺点是AAV介导的基因表达相对较慢，因为在异源基因表达之前单链AAV DNA必须转化为双链DNA。虽然已尝试通过构建双链DNA载体来规避这个问题，但是这种策略进一步限制可以整合入AAV载体的转基因表达盒的大小(McCarty, 2008; Varenikaet al., 2009; Foust et al.，2009)。此外，在生长器官中，高效的AAV介导的基因治疗可能由于分裂细胞中的游离DNA稀释而丧失其效果(Cunningham et al.，2009)。本专利技术通过提供用于向细胞、组织、器官或对象体外、离体或体内递送外源DNA的重组AAVO ( “rAAVO” )载体来解决与AAV载体相关的一些或全部上述缺点。专利技术概沭本专利技术是基于这样的发现，可以将外源DNA整合入没有衣壳的AAV基因组(或载体)(即，AAV0)并递送入靶细胞、组织、器官或对象，以高效表达感兴趣的蛋白或核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)而无需病毒衣壳介导的吸收过程。在本专利技术之前，据认为衣壳对于病毒载体高效吸收入细胞是必需的，并且不愿意免去它。事实上，纯化AAV载体的方法主要基于针对衣壳的抗体，这会抛弃未衣壳化的DNA，或者基于使用DNAase，DNAase会降解任何未衣壳化的DNA。将本专利技术的rAAVO载体与基于质粒的表达载体区分开的结构特征包括在rAAVO载体中缺少原始(即未插入)细菌DNA，rAAVO载体缺少原核复制起点，rAAVO载体是自足(self-containg)的(即它们不需要除两个ITR以外的任何序列)，包括Rep结合位点和末端分辨位点(terminal resolution site) (RBS和TRS),以及在ITR之间的外源序列,存在形成发夹的ITR序列，事实上rAAVO具有真核起点(即，它们在真核细胞中制备)，并且不存在细菌类型的DNA甲基化或哺乳动物宿主认为异常的任何其他甲基化。一般来说，本专利技术的载体优选不含任何原核DNA，但是考虑一些原核DNA可以作为外源序列插入。将rAAVO载体与质粒表达载体区分开的另一重要特征是rAAVO载体由单链或双链线性DNA组成，而质粒通常是双链DNA。本专利技术的rAAVO载体 与基于质粒的表达载体相比的一些优势包括但不限于:1)质粒包含细菌DNA序列并进行原核特异性甲基化，即嘌呤碱甲基化,而rAAVO载体序列具有真核起点；2)质粒在制备本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·加西亚，C·贝莱，T·福伊特，R·M·科廷，
申请(专利权)人：肌肉学研究协会，皮埃尔玛丽居里大学巴黎第六大学，国立科学研究中心，国家健康与医学研究院，美国卫生与人类服务署国立卫生研究院，
类型：
国别省市：