共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用,将Furin裂解位点和FMDV2A自剪切肽联合运用，使得两个抗关节炎融合蛋白TNFR-Fc和CTLA4-FasL在同一重组腺相关病毒（AAV2）载体上于体外和体内均获得了独立共表达，并发挥各自的生物活性。实验证明，含有本发明专利技术重组腺相关病毒载体的重组子介导表达的TNFR-Fc和CTLA4-FasL蛋白具有与母本蛋白相同的生物活性,含有TNFR-Fc和CTLA4-FasL双融合分子的重组腺病毒载体比表达单分子的重组腺病毒载体能更有效地抑制关节炎的发展，表明其可在制备预防和治疗关节炎（特别是类风湿性关节炎）药物中应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒载体，特别是涉及一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体及其构建方法与其在制备预防和治疗关节炎(特别是类风湿性关节炎)药物中的应用。
技术介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种主要累及关节的慢性自身免疫病，其特征为炎性细胞浸润和滑膜增生，导致关节软骨和骨破坏。RA发病机制复杂，许多因素参与其中，包括关键的促炎细胞因子TNFa和T淋巴细胞，二者被认为在RA进程中发挥重要作用。生物治疗尤其是TNF抑制剂已经在RA临床治疗中取得了巨大成功，包括p75TNFR-Fc融合蛋白，然而，仍然有相当一部分病人对此种治疗无效，因此迫切需要其它辅助或协同治疗方法。此外，鉴于RA发病机制的复杂性，联合阻断不同致病因素已成为很有吸引力的治疗策略，尤其是以T淋巴细胞为靶联合TNF α抑制。一些动物研究提示，联合阻断T淋巴细胞和TNF α，很可能比单独阻断TNF α能更有效地治疗RA。因此，TNF α抑制剂TNFR-Fc和T淋巴细胞抑制剂CTLA4-FasL的联合应用具有一定发展前景。T淋巴细胞在类风湿性关节炎(RA)发病的起始和进展过程中都发挥关键作用，在RA患者的关节腔和滑膜中均可观察到大量浸润的T淋巴细胞，因此清除T淋巴细胞成为RA治疗的一种有效策略。C TLA4-FasL融合分子将CTLA4胞外区和FasL胞外区融合在一起，一方面通过CTLA4功能域阻断T淋巴细胞激活的共刺激信号，另一方面通过FasL功能域诱导活化T淋巴细胞凋亡，从而通过共刺激阻断和凋亡诱导发挥对T淋巴细胞的双重抑制作用。在前期研究中，首先证明腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)介导的CTLA4_FasL基因转移能够有效抑制大鼠佐剂诱导性关节炎(AIA，一种T淋巴细胞依赖的RA动物模型)，并明显减少关节中T淋巴细胞浸润，进一步研究表明CTLA4-FasL比单独FasL分子能更有效地阻止关节炎的发展。以往的抗TNFa和抗T淋巴细胞联合治疗研究，应用的都是抗TNF α抗体和抗⑶3或CD4抗体。鉴于高循环水平治疗蛋白在人体内产生的副作用，使用抗体或者蛋白进行联合治疗并不利于今后的临床应用，例如，使用etanercept (抗TNF α蛋白)和anakinra (抗IL-1抗体)会增加严重感染的风险。此外，包括TNFa抗体在内的重组蛋白体内半衰期比较短，需要反复注射，费用昂贵。因此使用双抗体或蛋白联合治疗RA并不是理想的策略。内部核糖体进入位点(internal ibosome entry site, IRES)是小RNA病毒类中5’端非翻译区中的一段序列，其二级结构和三级结构构成了蛋白质翻译过程中核糖体的登陆平台，40s核糖体亚单位可以不依赖5’端帽子结构而在内部结合到mRNA上，从而直接对其后的结构基因进行翻译。IRES的这一特点可应用于构建同时表达两个基因的双顺反子真核表达载体。IRES是一个传统的介导双基因表达原件，但是由于其存在一些缺陷严重影响了其在多顺反子载体构建中的应用，主要有(I)转录起始效率较低，通常造成下游基因明显低表达，IRES介导的上、下游基因表达量不平衡，通常下游基因的表达量仅是上游的20% -50% ； (2) IRES自身结构较大，其应用常受到载体容量的限制。Furin裂解位点和2A自剪切序列作为一种新的技术方法，已被用于在单一开放阅读框中平衡共表达抗体重链和轻链。2A自剪切序列是由24个氨基酸组成的多肽，在最后两个氨基酸处完成自剪切，可介导上游基因和下游基因表达比例均衡，此外，2A序列肽不会引发体内特异的免疫反应。由于2A自剪切发生在2A肽C末端两个氨基酸残基之间，使得上游蛋白携带23个残留的2A肽段氨基酸，后者可能会影响上游蛋白的活性。为了消除残留的2A肽段可能产生的副影响，Furin裂解位点(RAKR)被引入到2A序列的上游，以去除残留的2A氨基酸。Furin是一种广泛存在于所有脊椎动物细胞的跨膜酶，可有效加工前体蛋白，它在许多细胞事件中发挥催化作用，并在许多疾病和感染中发挥作用。成功的基因治疗需要安全高效、稳定、持久表达的转基因载体。非病毒载体具有安全性高、容量大和易制备等优点，可能具有较好的应用前景，但其基因转染效率尚有待提高。尽管有多种病毒载体，如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等能导致外源基因高效转染与表达，然而其表现出的肝脏毒性、致炎性、免疫原性和潜在的致瘤性引起国内外学者对其安全性的深切担忧。腺相关病毒(AAV)属于微小病毒科依赖病毒属,是一种对人和动物不致病的单链脱氧核糖核酸病毒。将腺相关病毒自身的编码基因去除，仅保留基因组两末端的反向末端重复序列(ITR)，使其能装载治疗基因及表达元件而产生重组腺相关病毒(rAAV)。腺相关病毒可感染多种组织细胞，能稳定、持久地表达外源基因。腺相关病毒载体理化性质稳定，是目前基因治疗所使用的各种载体中最具优势和前途的载体之一。传统制备重组腺相关病毒是采用腺病毒辅助的转染方法，然而腺病毒污染的问题是其应用的障碍。寻找新的、更安全的制备方法可以使腺相关病毒载体进一步推广应用。局部基因治疗是一种具有吸引力的全身蛋白递送的替代方法。在病毒基因递送载体中，AAV似乎是最有希望用于临床治疗的一类 载体，而AAV2在动物研究中被应用的最多。AAV2 (腺相关病毒2型)可介导目的基因在体内长期表达，而且尚未发现由它直接引起的副作用，此外，关节中大多数细胞包括滑膜细胞和软骨细胞等均可被AAV2转导，而且AAV2似乎更倾向于转导炎性细胞，这些特点使得AAV2成为基因治疗RA的一个理想工具。AAV2介导的关节内基因转移已被证实是一种在关节局部高水平表达治疗蛋白从而阻止蛋白全身分布及副作用的有效策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL，且表达量平衡的重组腺相关病毒载体。本专利技术所提供的共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR-Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL基因的重组腺相关病毒载体。用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为pAAV2_neo、pAAV2neo_EFl α、pAAV2neo-HRE 或 pSDAVneo-CAG 等 AAV2 型载体，优选为 pAAV2_neo，所述 TNFR-Fc 基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4_FasL基因位于载体pAAV2_neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL的重组腺相关病毒载体为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。本专利技术的另一个目的是提供一种构建上述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体的方法，可包括以下步骤I)合成编码人 p75TNFR 胞外区(NCBI Genebank No. ΝΜ_001066· 2)的基因，在合成的人P75TNFR胞外区本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR?Fc和CTLA4?FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR?Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4?FasL基因的重组腺相关病毒载体。

【技术特征摘要】
1.一种共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体，是自上游至下游依次携带有TNFR-Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL基因的重组腺相关病毒载体。2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于用于构建上述重组腺相关病毒载体的出发载体为 pAAV2-neo、pAAV2neo_EFl α、pAAV2neo_HRE 或 pSDAVneo-CAG 等 AAV2型载体，优选为pAAV2-neo，所述TNFR-Fc基因、Furin裂解位点编码序列、2A自剪切肽编码序列和CTLA4-FasL基因位于载体pAAV2_neo中CMV启动子和BGH polyA尾两端的反向末端重复序列(ITR)之间。3.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4-FasL的重组腺相关病毒载体为TFCF，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。4.一种构建权利要求3所述共表达两个独立的抗关节炎分子TNFR-Fc和CTLA4_FasL 的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤1)合成编码人P75TNFR胞外区(NCBIGenebank No. ΝΜ_001066· 2)的基因，在合成的人p75TNFR胞外区基因中自5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Kpn I识别位点、Kozak 序列、起始密码ATG、TNFR的原始信号肽、人P75TNFR胞外区基因、限制性内切酶Asc I和 Pac I识别位点、终止密码子TGA和限制性内切酶EcoR I识别位点，在引入Asc I和Pac I识别位点时为了下游基因的正确编码，在Asc I识别位点后加了一个额外的碱基Α、在 Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的人p75TNFR胞外区基因命名为(KpnI) Kozak-ATG-s ignal-TNFR(Asc1-PacI) -TGA(EcoRI),其核苷酸序列如序列表中序列 I 所不， 将该基因克隆入载体PGEM-T中；2)合成编码IgGlFc(NCBI GenBank:AJ294730.1)的基因，在合成的IgGlFc基因中自 5’端至3’端依次包含有限制性内切酶Asc I识别位点、IgGlFc基因、6XHis标签和限制性内切酶Pac I识别位点，并在Asc I识别位点后加一个额外的碱基A，在Pac I识别位点后加了一个额外的碱基G，将此合成的IgGlFc基因命名为(AscI) IgGlFc-His(PacI),其核苷酸序列如序列表中序列2所示，将该基因克隆入载体pGEM-T中；3)用限制性内切酶KpnI和EcoR I将步骤I)合成的人p75TNFR胞外区基因(KpnI) Kozak-ATG-signal-TNFR(Asc1-PacI)-TGA (EcoRI)从载体 pGEM-T 上切下，将其连接入同样经Kpn I和EcoR I双酶切的载体pAAV2_neo中，得到携带人p75TNFR胞外区基因的重组载体PAAV2/TNFR，然后用限制性内切酶Asc I和Pac I将步骤2)合成的IgGlFc基因(AscI)IgGlFc-His(PacI)从载体pGEM-T上切下，将其连接入同...

【专利技术属性】
技术研发人员：于继云，张巍，王芳，阎瑾琦，王博，张晓郡，徐元基，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：