增强腺相关病毒载体功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变从而提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变，使它们与用来比对的功能性AAV衣壳序列中相应位点上的氨基酸相一致。

【技术实现步骤摘要】
本申请是国际申请PCT/US2006/013375，国际申请日2006年4月7日，中国国家阶段申请号200680010566. 6，名称“”的专利技术专利申请的分案申请。专利技术背景腺相关病毒(AAV)是细小病毒科(Parvovirus)家族的一个成员，它是小的无包膜、二十面体病毒，具有4. 7千碱基(kb)到6kb的单链线性DNA基因组。由于该病毒是作为纯化的腺病毒原种的污染物被发现的，AAV指定为依赖病毒属(Dependovirus)。AAV的生命周期包括潜伏期(AAV基因组在感染后位点特异性整合入宿主染色体)，感染期(腺病毒或单纯疱疹病毒感染后，整合的基因组接着得到拯救、复制并包装入感染的病毒)。非致病性、宽宿主范围(包括非分裂细胞)感染性以及潜在的位点特异性染色体整合的特性使得MV成为用于基因转移的有吸引力的工具。已经描述AAV载体用于治疗用和免疫原性分子的运载工具。迄今为止，已从人或非人灵长类(NHP)中分离了几种表征良好的不同AAV。最近，研究者描述了不同序列的大量AAV，并且将这些AAV表征为不同的血清型和分化体。已报道不同的AAV表现出不同的转染效率， 也表现出对不同细胞或组织的趋性。想要得到用于向不同细胞类型递送异源分子的基于AAV的构建体。专利技术概述 本专利技术提供了一种用于改善无功能和/或功能弱的AAV载体的方法。一方面，该方法提供了一种在选定的腺相关病毒(AAV)序列中校正单现突变 (singleton)以提高选定AAV的包装产量、转导效率和/或基因转移效率的方法。该方法包括改变亲代AAV衣壳中的一个或多个单现突变使所述单现突变与用来比对的功能性AAV衣壳序列中对应位点的氨基酸相一致。另一方面，本专利技术提供了经修正的AAV序列，即除去一个或多个单现突变的序列。又一方面，本专利技术提供了具有根据本专利技术修正的AAV衣壳的AAV载体。下述专利技术详述容易地表现出本专利技术的其他方面和优点。附图简述附图说明图1显示经单现突变校正的AAV载体的体外293转导。在载体名称之后标明了单现突变的校正(如果存在的话)，数字表示突变的数目。图2A-2C显示用293细胞测定的AAV载体在感染复数范围为IO1到IO4的滴度，其中，图2A比较亲代rh. 8和经单现突变校正的rh. 8 (rh. 8R)，图2B比较亲代rh. 37和经修正的rh. 37，图2C比较AAV2和AAV8。作为对照，还给出了 AAV2和AAV2/8 eGFP表达载体的相似滴定的结果。Y轴表示以流式细胞计数法测定的eGFP阳性细胞百分比(%)。图3是AAV序列的系统发生树，显示了它们的系统发生关系和所属分化体图 4A-4L 是 AAV2 、cy. 5 、rh. 10 、 rh.13、AAVl、AAV3、AAV6, AAV7、AAV8、hu. 13、hu. 26, hu. 37、hu. 53、rh. 39、rh. 43rh. 46的衣壳蛋白(vpl)核酸序列的比对。图 5A-5D 是 AAV2 、cy. 5 、rh. 10 、 rh. 13、AAVl、AAV3、AAV6, AAV7、AAV8、hu. 13、hu. 26, hu. 37、hu. 53、rh. 39、rh. 43rh. 46的衣壳蛋白(vpl)氨基酸序列的比对。图 6A-6B 是 rh. 13、rh. 2 、rh. 8 、 hu. 29 rh. 64的衣壳蛋白(vpl)氨基酸序列的比对。专利技术详述本专利技术提供了一种改善AAV载体功能的方法。本专利技术尤其适合于改善衣壳含一个或多个单现突变的AAV载体的包装产量、转导效率和/或基因转移效率。本专利技术进一步提供了根据本专利技术的方法鉴定和制备的新AAV衣壳序列。本说明书与权利要求书使用的术语“包含/含有”和“包括”包括其他成分、元素、 数值、步骤等等在内。相反，术语“由...组成”和其变体不包括其他成分、元素、数值、步骤等等在内。·本专利技术的单现突变方法如本文中所用的术语“单现突变(singleton) ”指在选定的(即亲代)AAV衣壳序列中的给定位点上的可变氨基酸。通过将亲代AAV衣壳序列与功能性AAV衣壳序列文库比对来确定可变氨基酸的存在。然后分析序列来确定亲代AAV衣壳中所有这样的可变氨基酸序列功能性AAV文库中的AAV序列在此氨基酸位置完全保守。然后改变亲代AAV序列，将单现突变改变为经鉴定功能性AAV衣壳序列在该位点上的保守氨基酸。根据本专利技术，亲代 AAV序列可能具有1-6、1-5、1-4、1-3或2个单现突变。亲代AAV序列也可能具有超过6个单现突变。一旦修正后，经修正的AAV衣壳可用于构建具有经修正衣壳的AAV载体。可使用本领域技术人员公知的技术来构建载体。根据本专利技术方法所选择的用于修正的AAV是想要与亲代AAV相比增强其下列三种功能特性之一或多种的AAV，所述的三种功能特性即包装成具有选定AAV序列的衣壳的病毒粒子，提高转导效率或增加基因转移效率。例如，与密切相关的其他AAV相比，亲代AAV 的特征可能在于具有较低的包装效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV 可能具有较低的转导效率。在另一个实例中，与密切相关的AAV相比，亲代AAV可能具有较低的基因转移效率(即体内递送靶分子的能力较低)。在其他的实例中，亲代AAV的上述各项功能都合格，但有待进一步提高其中一项或多项功能。因此，本专利技术提供了一种功能性AAV的文库，其中AVV的序列与选定的(亲代)AAV 形成对照。适宜的是，该文库包含具有目标功能的AAV,该目标功能正是欲在选定亲代AAV实现的改善。换句话说，该功能性AAV文库的每一序列的特征在于具有目标水平的包装能力、目标水平的体外转导效率或目标水平的体内基因转移效率(即在对象中向选定靶组织或细胞的递送能力)。组成文库的功能性AAV可分别具有这些功能性特征中的一种、两种或全部。本领域技术人员可容易地确定文库的其他目标功能。在一个实施方案中，功能性AAV是能产生具有与AAV1、AAV2、AAV7、AAV8或AAV9同等或更强包装和转导效率的病毒粒子的AAV。可用含AAV2r印和AAV2 ITR的假型包装设定(pseudotype setting)来测评功能。因此，可使用常规技术构建改变的亲代AAV,并且， 当与AAV2的产量相比，如果由所属亲代AAV产生病毒的滴度为至少50%时，则认为该AAV 载体是功能性的。另外，本领域技术人员可容易地确定AAV转导细胞的能力。例如，可构建亲代AAV使其包含易于测知病毒的标记基因。例如,让AAV包含eGFP或另一可进行突光检测的基因。如果AAV包含CMV-eGFP，当将由改变的亲代AAV衣壳产生的病毒以感染复数IO4 转导293细胞时，转导效率大于全部细胞GFP荧光的5%时表示有功能，其中，所述细胞以感染复数20用野生型人5型腺病毒预处理2小时。适宜的是，文库由至少三种或至少四种功能性AAV衣壳序列组成，所述序列代表至少两种不同的分化体。优选地，文库包含各代表性分化体的至少两个序列。在某些实施方案中提供了三个、四个、五个、六个或更多的分化体。“分化体”指基于AAV vpl氨基酸序列比对，经邻接算法、自展值(Bootstrap value)为至少75% (至少1000次复制)确定，并且泊松本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种腺相关病毒AAV6.2载体，具有经修饰的AAV6衣壳，所述衣壳具有经修饰的SEQ?ID?NO:29所示氨基酸序列，其中氨基酸残基位点129处的原苯丙氨酸改为亮氨酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：L·范登伯格，G·高，J·M·威尔森，
申请(专利权)人：宾夕法尼亚大学托管会，
类型：发明
国别省市：