热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用及其表达系统和重组表达载体技术方案

本发明专利技术公开了热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用及其表达系统和重组载体，能够通过温度诱导或关闭siRNA的表达，从而控制目的基因的表达，其调控方便，不需要表达调控蛋白，能够避免机体发生免疫反应；同时在非诱导条件下不存在漏表达，将热休克蛋白基因启动子用于构建表达系统和重组载体，下游连入siRNA序列后，在热刺激下能够诱导siRNA高效表达，从而抑制目的基因的表达，为基因的靶向治疗提供了有力的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及热休克蛋白基因启动子在调控SiRNA表达中的应用，还涉及含有热休克蛋白基因启动子的表达系统和重组表达载体。
技术介绍
RNA干涉(RNAinterference, RNAi)是近年来发现的在生物体内普遍存在的一种古老的生物学现象，是由dsRNA介导的、特定酶参与的特异性基因沉默现象，它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达，该机制是真核生物体抵抗外源基因(如病毒 基因、转座子、人工转入基因等)入侵的一种保护性反应，也是生物体在不同时期通过调控基因表达来调节细胞分化的机制。1999年，Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现，21-25nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要，同时指出RNAi作用是由部分纯化的核酸酶中所含的siRNA介导的。Zamore等用dsRNA转染未经dsRNA处理过的果蝇胚胎细胞的提取物，结果发现只有在特异性dsRNA存在的条件下mRNA才被降解，而且断裂的位置仅限于dsRNA的相应序列，进一步证明mRNA的断裂是以siRNA为模板。Smallinterfering RNA (siRNA)是一种小 RNA 分子( 21-25 核苷酸)，由 Dicer (RNAase 6 家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成员，具有介导与之互补的目标mRNA降解的作用。siRNA的产生主要通过两种手段，一是直接合成RNA片段，另一种是通过载体复制得到的，也是现阶段应用最广的方法。但以往构建的大多数siRNA载体不能在沉寂目的基因的表达量上进行调控，因此在应用siRNA技术研究一些特定基因如与细胞生长、发生、发展密切相关的基因时，由于不能精细调控抑制目的基因的表达程度可能同时会影响正常细胞的生长与增殖。因此可调控、可诱导系统被认为是未来RNAi的重要发展方向。诱导型siRNA可以通过诱导物来调节RNAi系统，从而实现目的基因的定量诱导表达抑制。目前应用的诱导体系有cre210XP系统，四环素诱导体系，蜕皮素诱导体系和乳糖诱导体系。应用最多的诱导剂有四环素、蜕皮素类。目前诱导型RNAi技术已应用到肿瘤基因治疗的相关研究中，如结肠癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的细胞体外研究和实验动物的体内研究已经卓有成效，为肿瘤的基因治疗提供了新的思路。但是当前的可调控系统主要存在以下2种缺陷(I)免疫反应调控元件一般会生成蛋白类反应因子，在体内触发宿主 I型王要组织相容性抗原复合物(MHC-1 )介导的免疫反应，Ginhoux等在rtTA上发现⑶8+特异性抗原簇，激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)导致rtTA表达阳性祀细胞的裂解；(2)漏表达(leaky expression)即在调控抑制状态下存在不同程度目的基因的表达，形成背景噪音。由于哺乳动物的基因系统是复杂的多级、多途径环路，基础表达不可避免。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供热休克蛋白基因启动子在调控SiRNA表达中的应用， 不表达多余的蛋白类反应因子，避免了调控蛋白在机体中发生免疫反应，同时调控精确，不存在漏表达。为实现上述专利技术目的，技术方案为热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用。优选的，所述热休克蛋白基因启动子如SEQ ID NO. 3中第9-347位所示的核苷酸序列。优选的，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。本专利技术的目的之二在于提供含有热休克蛋白基因启动子的siRNA表达系统，能够用于表达siRNA,技术方案为含有所述热休克蛋白基因启动子的siRNA表达系统。优选的，所述热休克蛋白基因启动子如SEQ ID NO. 3中第9-347位所示的核苷酸序列。优选的，所述热休克蛋白基因启动子的3’端还 含有内含子剪切位点保守序列。更优选的，所述内含子剪切位点保守序列的核苷酸序列为actagtac (Nn) ctgctagc ；其中N表示任意碱基，η表示任意数字。更优选的,所述内含子剪切位点保守序列的核苷酸序列为actagtacctcgagcggggg gtaccctgctagc。本专利技术的目的之三在于提供含有所述热休克蛋白基因启动子重组载体，受热调控灵敏，43°C条件下能够诱导热休克蛋白基因启动子下游基因表达，技术方案为含有所述热休克蛋白基因启动子重组表达载体。优选的，由以下步骤制得将SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列经BglII和XbaI双酶切后连入经同样双酶切的PCDNA3.1 ( + )载体，然后用增强绿色荧光蛋白基因替换新霉素基因，得含热休克蛋白基因启动子的重组表达载体。本专利技术的有益效果本专利技术公开的热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用，调控表达时不需要表达调控蛋白，避免了机体产生免疫反应，同时无毒副作用；还公开了含有热休克蛋白基因启动子的表达系统和重组表达载体，可利用温度来调控siRNA的表达，诱导表达时，siRNA表达量高，沉默靶基因的能力强，在非诱导情况下，siRNA表达量极低，对靶基因几乎无沉默效应，为基因的靶向治疗提供了有力的工具。附图说明图1 pMHSP70psil 质粒图谱。图2为MCF-7转染24小时后细胞的荧光表达结果。图3实时荧光定量PCR检测不同实验组SNCG基因的表达量。图4Western_blot检测不同实验组的SNCG蛋白含量。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。一、人类HSP70启动子的扩增 乳腺癌细胞株MCF-7 (由重庆大学生物工程学院杨力教授提供)在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在37°C、5%的CO2培养箱中培养36小时，然后用质量分数为0. 25%胰酶在25°C条件下消化3-5分钟，再在转速为3500rpm条件下，离心3min，收集细胞，用细胞基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN)提取基因组总DNA，作为模板。根据NCBI中报道的HSP70基因启动子的序列设计HSP70基因启动子的引物序列，上游引物为5’ -ggtagatctcactctggcctctgattggt-3’ (SEQ ID NO.1),下划线为 BglII 识另丨J位点，下游引物为5，-gctctagaactagtacctcgagcggggggtaccctgctagcctggaaacggaacactgga-3’ (SEQ ID NO. 2)，第一处下划线为XbaI内切酶识别位点，第二下划线和第三下划线分别为XhoI和KpnI内切酶识别位点。其中XhoI和KpnI内切酶识别位点为方便在启动子下游插入表达序列，并且在XhoI和KpnI内切酶识别位点的两侧还设计有内含子剪切位点保守序列(黑体部分)。然后以提取的基因组总DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO. 2所示序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为94°C预变性lmin30s ;94°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸40s，总共35个循环；最后72°C延伸10分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后回收目的片段，经测序获得如SEQ ID本文档来自技高网...

【技术保护点】
热休克蛋白基因启动子在调控siRNA表达中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐丽灵，廖意，冯建国，易茜，崔瀚威，何玲，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：