本发明专利技术属于生物医药领域，涉及本发明专利技术涉及重组腺相关病毒载体及其制备和应用。进一步地，本发明专利技术涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlk1的重组腺相关病毒载体及其构建方法和抗肿瘤效应。本发明专利技术的重组腺相关病毒载体具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用小，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
重组腺相关病毒载体及其制备和应用本专利技术属于生物医药领域，涉及内皮抑素(Endostatin，ES)与TRAIL目的基因的克隆，及Plkl的RNAi序列设计。进一步地，本专利技术涉及含有Endostatin-TRAIL-ShPlkl的重组腺相关病毒载体及其构建方法和抗肿瘤效应。本专利技术的重组腺相关病毒载体具有明显的抗肿瘤作用，且毒副作用小，具有良好的应用前景。
技术介绍
恶性肿瘤是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的重大疾病之一。目前临床上主要是采用放射治疗及化学疗法。然而，有些恶性肿瘤对放射治疗不敏感，且有些患者对化疗易产生耐药性，因此寻找新的有效治疗肿瘤的方法是临床医生与患者的急切愿望 。随着生物工程技术的发展，基因治疗肿瘤成为研究热点，其中治疗基因可以是抑癌基因或诱使肿瘤死亡的基因，也可以是各种细胞因子或免疫原性基因。如将多种抑癌基因或凋亡诱导基因导入肿瘤细胞以抑制肿瘤生长或凋亡。还可以使用反义基因技术，核酸技术或RNA干扰技术来封闭或降解基因或其产物以达到治疗目的。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成，通过抑制肿瘤新生血管生成，也是治疗肿瘤的一种途径。在内源性血管生成抑制因子中，内皮抑素最引人注目，在体外它对内皮细胞具有明显的增殖抑制活性。在体内，其可特异性地抑制内皮细胞增殖和新生血管形成，从而抑制肿瘤生长。但国内外均有文献报道ES需与化疗药物联用才有较好的效果(ClinCancer Res，2004，10 (I pt I) :33-42.;中国肺癌杂志，2005，8 (4) :283-290.临床肿瘤学杂志，2007，12(10) :728-735.)肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子(tumornecrosis factor,TNF)超家族的成员之一，它能选择性地杀死肿瘤细胞，而对大多数正常细胞却无杀伤作用(生命科学，2007，19 :492-495)。TRAIL与受体结合后，除激活凋亡诱导信号途径外，还能激活Akt途径、核因子KB(NF-KB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员等。反过来，这些被活化的途径或因子能调节TRAIL的凋亡诱导活性(Int J Mol Med, 2006,18 505-510.)。Polo样激酶I (polo-like kinase I, PLK1)是一种广泛存在于真核细胞中的丝/苏氨酸激酶，在细胞周期调控中发挥关键的作用。现已发现PLKl在多种肿瘤中表达增高并与某些肿瘤的预后密切相关。通过利用反义寡核苷酸、RNA干扰技术和化学合成PLKl小分子抑制剂等方法阻断PLKl的表达或降低其激酶活性，可显著抑制Plkl基因及其蛋白表达，有效阻止肿瘤细胞的生长和增殖，进而能够有效抑制肿瘤细胞的增殖并介导肿瘤细胞的凋亡(Nature Chemical Biology, 2006, 2 (12) :711-717, World J Gastroenterol, 2005,11(29) :4596-4599)。但RNA干扰技术存在稳定性和脱靶效应等问题(Gerie Ther, 2006,13:464 Nucleic Acids Res,2005，33 :452)。腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。迄今为止，尚未发现与AAV相关的疾病报道，因此被公认为是最安全的病毒载体，成为目前基因治疗载体研究的热点。但由于包装容量的限制，其多用于单一基因的转导(Curr Opin Mol Ther. 2003 ;5 (4) :367-75.)。
技术实现思路
恶性肿瘤的发生主要是由于多种因素诱发机体细胞的基因突变，即基因的缺陷或异常所致。本专利技术率先选择多途径抑制肿瘤新生血管生成；诱导肿瘤细胞凋亡；并结合RNA干扰PLKl的表达来抑制肿瘤细胞生长来联合抗肿瘤。具体而言，本专利技术首次将Endostatin、TRAIL、ShPlkl三基因克隆构建于同一 AAV载体上，经包装纯化后获得新型重组腺相关病毒载体。经实验显示，本专利技术的新型重组腺相关病毒载体具有显著的抗癌作用。所以，本专利技术的第一方面提供了一种重组载体，该载体含有如下三种能在体内表达的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL和ShPlkl。优选地，本专利技术的载体为病毒载体， 例如腺相关病毒载体。备选地，本专利技术所提供的重组载体中所含有的三种基因或核苷酸序列是通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接的。例如通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。示例性地,本专利技术的重组载体是如图I所示的。示例性地,本专利技术的Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通过以从人胎盘组织提取的总RNA为模板，以SEQ ID NO :1和2为引物进行RT-PCR扩增获得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列。示例性地，本专利技术的TRAIL基因或核苷酸序列是通过以TRAIL (SolubleTRAIL，95-281AA)基因为模板，以SEQ ID NO :5和6为引物进行PCR扩增获得的目的TRAIL(I14-281 AA，507bp)。示例性地，本专利技术的ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl载体(上海吉玛制药技术有限公司，商品名pGPHl Plasmid.)模板，以SEQ ID NO :7和8为引物通过PCR扩增，获得的ShPlkl (392bp)的目的片段。应当理解，本专利技术在的上述或在实施例中所述的导入至载体中的目的序列仅仅是示例性的。本领域技术人员将会明白，可以对本专利技术的导入的目的序列进行适当的修饰，前提是修饰后的目的序列保持各自的生物学活性。在本专利技术的教导下，这种修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的。例如通过保守性突变可将Endostatin基因或核苷酸序列和/或TRAIL基因或核苷酸序列进行修饰。对于本专利技术的ShPlkl基因或核苷酸序列，本领域技术人员根据干扰RNA的设计原理可对其序列进行适当的改变或修饰，只要修饰或改变后的ShPlkl基因或核苷酸序列能抑制Plkl基因及其蛋白表达。总之，专利技术人认为，不应当将本专利技术的导入的目的基因或核苷酸序列限制为实施例中所例举的那些。本专利技术另一方面提供了制备本专利技术的重组载体的方法，具体包括以下步骤(I) pAAV-Endostatin-IRES-TRAIL-ShPlkl 质粒的制备具体地，先从人胎盘提取RNA，进行Endostatin基因克隆，获得目的基因大小为612bp，同样从人胎盘的RNA，克隆TRAIL基因，获得507bp大小的目的基因；再用PCR法从P1424 质粒扩增获得 392bp ShPlkl (1424)片段。将 pAAV_IRES_hrGFP 质粒改造，在 PolyA的下游的Cpo I的位点处插入ShRNA序列元件，获得pAAV-IRES-hrGFP-ShRNA质粒，分别依次将 TR本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组载体，该载体含有如下三种能在体内表达的基因或核苷酸序列：Endostatin、TRAIL和ShPlk1。
【技术特征摘要】
1.重组载体，该载体含有如下三种能在体内表达的基因或核苷酸序列Endostatin、TRAIL 和 ShPlkl。2.根据权利要求I所述的载体，其为病毒载体，例如腺相关病毒载体。3.根据权利要求I或2所述的载体，其中含有的三种基因或核苷酸序列是通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接的，例如通过沿着腺相关病毒载体的转录方向依次可操作地连接有Endostatin基因或核苷酸序列、IRES序列、TRAIL基因或核苷酸序列、ShPlkl基因或核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的载体，其是如图I所示的重组腺病毒载体。5.根据上述权利要求任一项所述的重组载体，其中Endostatin基因或核苷酸序列的序列是Endostatin基因的序列通过以从人胎盘组织提取的总RNA为模板，以SEQ ID NO : I和2为引物进行RT-PCR扩增获得的目的Endostatin (612bp)基因或核苷酸序列；和/或 TRAIL基因或核苷酸序列是通过以TRAIL(Soluble TRAIL,95-281AA)基因为模板，以SEQ ID NO :5和6为引物进行PCR扩增获得的目的TRAIL(114-281AA，507bp);和/或 ShPlkl基因或核苷酸序列是以PGPHl载体(上海吉玛制药技术有限公司，商品名...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐升斌，程笠人，肖艳桃，田晶，谭孟群，
申请(专利权)人：深圳市湘雅生物医药研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。