本发明专利技术公开了一种G蛋白偶联受体对化合物特异性的检测方法，该方法包括以下步骤：制备重组HEK-293细胞悬液；在细胞悬液中加入腔肠素，得到重组细胞液；将重组细胞液分为对照组和待测组，在待测组中加入待测化合物溶液，在对照组中加入Hank's平衡盐溶液；若待测组发出的荧光信号强度高于对照组，具有显著差异，则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有激活作用，反之则无；继续在待测组中加入GPCR相应的激动剂，检测其荧光信号；若检测到的荧光信号强度显著低于对照组，则说明该待测化合物对重组的HEK-293细胞中的GPCR有抑制作用，反之则无。本发明专利技术所提供的方法是一种灵活可变的检测模式，不但可以通过已知GPCR来检测未知化合物，而且可以通过已知化合物来反向检测与其特异性结合的GPCR。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种G蛋白偶联受体对化合物特异性的检测方法。
技术介绍
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor,GPCR)是一类含有7个跨膜α螺旋的膜蛋白，是人类细胞膜表面最大的受体家族。在人类的基因组中约有800个基因编码GPCR蛋白。当膜外的配体作用于GPCR受体时，该受体的膜内部分与G蛋白结合，从而激活G蛋白。G蛋白通过多种信号传导途径将细胞外信号传递至细胞内，对生长发育、生殖、免疫、神经传导、代谢以及行为都有重要的调控作用。GPCR配体种类非常广泛，涵盖了味觉、嗅觉、光、金属离子、生物胺、脂肪酸、留体等 类别。约有80%的激素、神经肽和神经调节物质的信号传递都是由GPCR蛋白介导。GPCR与人类的各类疾病(包括心血管疾病、胃肠道疾病、神经系统疾病、免疫疾病以及肿瘤的诱发和扩散等)密切相关。世界各大制药公司目前都在积极开发以GPCR为靶点的药物。近20年来，被美国FDA批准上市的药物中，40% 50%是针对GPCR作为靶标的药物。GPCR介导的信号传导主要有以下几种途径一、由第二信使cAMP介导的信号通路。激动型G蛋白(Stimulatory G protein,Gs)偶联受体与其特异配体结合后，激活腺苷酸环化酶(AC)活性；而抑制型G蛋白(Inhibitory G protein,Gi)偶联受体与配体结合后,抑制AC的活性。AC可催化腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)转变成环腺嘌呤核苷三磷酸(cAMP)，从而引起一系列的细胞生物活动，如打开离子通道，激活蛋白激酶A (PKA)等(见图I虚线左侧示意图)。目前，基于cAMP信号传导的化合物特异性检测方法主要是通过检测cAMP浓度的变化来判断化合物是否激活GPCR信号通路。cAMP浓度的变化一般通过荧光共振能量转移(FRET)的方法来测定。该测定方法价钱昂贵，且抑制型GPCR信号通路试验常常会伴随太强的干扰信号。第二、由IP3介导的信号通路。Gqm蛋白(与磷酸脂酶C活化相关G蛋白)偶联受体与配体结合后会激活β磷酸脂酶CXPLC-β )，ΡΙΧ-β裂解其底物ΡΙΡ2生成ΙΡ3和DAG。ΙΡ3浓度的增加刺激内质网释放钙离子，导致细胞质内钙离子浓度迅速增加；同时非极性的1，2-DAG在质膜上激活蛋白激酶C (PKC)，使细胞内相关蛋白质磷酸化，从而起到调节这些蛋白质的活性的作用(见图I虚线左侧示意图)。基于IP3信号传导原理的化合物特异性检测方法主要通过检测钙离子浓度的瞬时变化来检测。钙离子浓度的测定方法一般需要荧光标记的钙离子浓度指示剂，主要包括化学合成的荧光指示剂和通过生物体表达的荧光指示剂。测定方法包括钙敏发光蛋白水母素测定法、β -arrestin发光共振能量转移测定法(FRET)、钙离子染色法(FLIPR)等。除以上两种GPCR信号传导途径外，还有少部分信号通路是通过G12/13蛋白偶联受体传导的。以上不同类型GPCR对化合物的检测方法只能针对某一类型的GPCR信号通路，不能同时适用于其它的GPCR信号通路。并且，以上常规的GPCR化合物特异性检测方法通常需要构建稳定的细胞株，而构建稳定的细胞株耗时耗力。少数公司和科研机构利用形态学电阻抗原理对GPCR信号进行检测，但这类技术成本极其昂贵，常规客户难以承受。因此，在GPCR化合物特异性检测服务市场上，对低成本、高效率的检测方法有巨大的需求。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术的首要目的在于提供一种重组的HEK-293细胞的制备方法，该制备方法是利用瞬时转染技术将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒和水母发光蛋白质粒共转染HEK-293细胞。本专利技术的第二目的在于提供由上述方法制备得到的重组的HEK-293细胞。本专利技术的第三目的在于提供上述重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用一是用一种GPCR检测多种未知的化合物，以检测出与该GPCR能特异性结合的 化合物；二为用一种化合物检测多种GPCR，以检测出能与该化合物特异性结合的GPCR。本专利技术的GPCR化合物特异性检测方法不需要构建稳定的细胞株，且能将细胞内复杂多变的GPCR信号通路统一为钙离子传导的GPCR信号通路，适用于所有GPCR信号通路的检测，检测的灵敏度高、周期短、成本低。本专利技术的目的通过下述技术方案实现一种重组的HEK-293细胞的制备方法，包括以下步骤(I)制备HEK-293细胞悬液将HEK-293细胞分散于无血清培养基中，悬浮培养后得到HEK-293细胞悬液；(2)制备质粒混合物将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比3:1:1加入到无血清培养基中，得到GPCR质粒混合物；(3)配制转染复合物将聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine, PEI)加入到无血清培养基中，得到PEI试剂；聚乙烯亚胺的质量是水母发光蛋白质粒质量的2 10倍；(4)将GPCR质粒混合物与PEI试剂混合均匀，室温静置5 15分钟，得到转染复合物；(5 )转染HEK-293细胞将转染复合物加入到HEK-293细胞悬液中，悬浮培养48 72小时，得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞；步骤(I)所述的悬浮培养是悬浮培养24 48小时，所述的HEK-293细胞悬液中HEK-293细胞的浓度为IO4 IOfVmL ；步骤(2)所述的GPCR 质粒为质粒 GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EP1、EP4、EP3、A1、GRPR、HTR4、HRH1、END0、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、 β2、NKl、NMBR、BI、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSRl、UTR2、VIA、MTLR、FPRl、IP、LPAR3、LPAR2 或HTR2A中的一种；步骤(I)- (3)中所述的无血清培养基是在Free Style 293培养基中添加了O.05% (质量体积比)的F-68试剂；步骤(I)和(5)所述悬浮培养的条件是37°C、5% C02、10(T200rpm悬浮振荡培养。由上述方法制备得到的重组的HEK-293细胞可以用于GPCR化合物特异性检测。上述重组的HEK-293细胞在GPCR化合物特异性检测中的应用，具体包括以下步骤(I)将重组的HEK-293细胞分散于无血清培养基中，悬浮培养后得到重组HEK-293细胞悬液；(2)往步骤(I)的重组HEK-293细胞悬液中加入腔肠素(Coelenterazine),腔肠素与重组HEK-293细胞悬液的体积比为I: (1000^2000)，悬浮培养30分钟后得到重组细胞液；(3)用 Hank’s 平衡盐溶液(Hank，s Balanced Salt Solution, HBSS)稀释待测化合物，得到待测化合物溶液； (4)将重组细胞液分为对照组和待测组，往待测组中加入待测化合物溶液，往对照组中加入Hank’s平衡盐溶液；(5)GPCR激活实验检测对照组和待测组中重组的HEK-293细胞发出的荧光信号；若待测组发出的荧光信号强度高于对照组，则说明该待测化合物对所检测的GPCR有激活作用，反之则无；(6) GPCR抑制实验再往步骤(5)的待测组和对照组中加入GPCR本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组的HEK？293细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将HEK？293细胞分散于无血清培养基中，悬浮培养后得到HEK？293细胞悬液；（2）将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比3:1:1加入到无血清培养基中，得到GPCR质粒混合物；（3）将聚乙烯亚胺加入到无血清培养基中，得到PEI试剂；聚乙烯亚胺的质量是水母发光蛋白质粒质量的2~10倍；（4）将GPCR质粒混合物与PEI试剂混合均匀，室温静置5~15分钟，得到转染复合物；（5）将转染复合物加入到HEK？293细胞悬液中，悬浮培养48~72小时，得到转染了三种质粒的重组HEK？293细胞。
【技术特征摘要】
1.一种重组的HEK-293细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤 (1)将HEK-293细胞分散于无血清培养基中，悬浮培养后得到HEK-293细胞悬液； (2)将GPCR质粒、G蛋白突变体质粒与水母发光蛋白质粒按质量比3:1:1加入到无血清培养基中，得到GPCR质粒混合物； (3)将聚乙烯亚胺加入到无血清培养基中，得到PEI试剂；聚乙烯亚胺的质量是水母发光蛋白质粒质量的疒10倍； (4)将GPCR质粒混合物与PEI试剂混合均匀，室温静置5 15分钟，得到转染复合物； (5)将转染复合物加入到HEK-293细胞悬液中，悬浮培养48 72小时，得到转染了三种质粒的重组HEK-293细胞。2.根据权利要求I所述的重组的HEK-293细胞的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的悬浮培养是悬浮培养24 48小时，所述的HEK-293细胞悬液中HEK-293细胞的浓度为IO4 106/mL。3.根据权利要求I所述的重组的HEK-293细胞的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的 GPCR 质粒为质粒 GAL2、LTD4R2、LTD4R1、HRH2、GCGR、SST2、SST5、EPI、EP4、EP3、Al、GRPR、HTR4、HRH1、END0、MCHR2、M3、M1、PTH1R、D2、D1、HTR2A、FP、TP、β 2、ΝΚ1、NMBR、BI、ADRA1A、EDG3、OXTR、E2、NTSRl、UTR2、VIA、MTLR、FPRl、IP、LPAR3、LPAR2 或 HTR2A 中的一种。4.根据权利要求I所述的重组的HEK-293细胞的制备方法，其特征在于步骤(1)-(3)中所述的无血清培养基是在Free Style 293培养基中添加质量体积比为O. 05%的F-68试剂。5.—种重组的HEK-293细胞，其特征在于是由权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。6.权利要求5所述的重组的HEK-293细胞在GP...
【专利技术属性】
技术研发人员：任辉，黄斌，辛晓燕，韩蓝青，张曙光，
申请(专利权)人：海狸广州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。