一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白。Cre融合蛋白功能检测细胞，宿主细胞为HEK293细胞，将pAcmv-stop-EGFP载体和phiC31整合酶共转染宿主细胞。通过phiC31整合酶的作用，使得携带检测Cre重组酶功能的LoxP元件的载体以单拷贝的形式整合到HEK293细胞系的假attP位点，为研究Cre融合蛋白穿膜效率和生物活性提供稳定可靠的细胞模型。经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白HNTC，其穿膜效率高、生物活性好，可有效地作为哺乳动物细胞染色体水平上基因操作的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于重组功能检测细胞
，涉及一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白。
技术介绍
Cre属于重组酶家族，它是来源于Pl噬菌体，能够作用于哺乳动物细胞引起DNA序列特异性重组蛋白(Nagy A:Cre recombinase: the universal reagent for genometailoring. Genesis 2000，26:99-109)，它是由Pl噬菌体编码的大小为38kD的蛋白，能识别34bp大小的Ioxp位点。重组酶对底物的构形要求不严格，可以是超螺旋DNA，也可以是线性DNA。在Cre酶的作用下，两个同向Ioxp位点之间的DNA片段将会被删除；两个反向 Ioxp 位点之间的 DNA 将会发生翻转(Hoess R H, Abremski K. Mechanism of strand cleavage and exchange in the Cre Iox site specific recombination system.MolBiol, 1985，181 (3) :351-362.)Cre酶介导的遗传重组可进行定点、定时、定组织的特异性控制。该系统于1981年被首次发现，1993年被Gu等(Gu H, Zou Y R, RajewskyK.Independent control of immunoglobulin switch recombination at individualswitch regions evidenced through Cre-LoxP-mediated gene targeting.Cell, 1993，73 (6) : 1155-1164.)研究人员正式作为一种基因操作手段应用以来已广泛地应用于基因克隆、基因捕获、基因整合、基因删除等研究领域并体现出巨大优势。Cre重组酶通过对DNA进行准确切割和重新连接，能够介导靶DNA发生包括倒位、易位、切离或整合等形式的重排，从而使得在染色体水平对真核生物基因组进行遗传改造，以及对转基因动物和植物中转基因的表达进行有效的控制成为可能。该系统目前已成为在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的定点整合、基因捕获以及染色体工程等方面进行研究的有力工具，并在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面得到广泛的应用。因此，有必要构建一种哺乳动物细胞检测细胞系。目前用于构建的检测cre/loxp系统效率的元件，多为将一个组成型启动子和一种报告基因中间用多个顺式串联的转录终止子阻断，终止子两侧有两个同向LoxP，然后通过细胞转染或者病毒转导等方式，随机整合(或其他方法)或定点打靶到哺乳动物细胞基因组上。但是，这种随机整合(或其他方法)可能产生以下情况1.插入突变病毒载体介导的整合容易导致插入突变引起细胞建系失败；2.基因沉默而非病毒载体的随机整合也容易整合到异染色质区，引起转基因沉默，使得新建立的细胞系无法正常表达报告基因，而不能正常指示ere切割效率；3.非单拷贝整合在排除前两种情况的前提下，假定非病毒载体随机整合位点均位于转录活跃区，如果发生了非单拷贝整合，除了可能影响细胞正常生长外，多余的LoxP序列也会影响到Cre重组酶功能的验证。而在哺乳动物细胞中，链霉菌噬菌体c31整合酶被证明是可以与基因组DNA中特异性序列(即假attP位点)进行反应的整合酶，它可以将外源基因稳定地整合到哺乳动物细胞基因组的那些特定的序列上，其偏向于以单拷贝整合到基因组转录活跃区，从而极大降低了外源基因随机插入造成的基因突变风险。已被发现的c31整合酶识别的细胞基因组特异性位点有一百多个，对整合位点的生物信息学分析表明它们有较好的安全性(T. ff. Chalberg, et al.Integration specificity of phiC31 integrase in the humangenome. J Mol Biol. 2006. 357. 28-48)，提示其作为在哺乳动物细胞中进行基因操作和基因治疗的一个有用的工具，适合用于验证Cre穿膜肽效率细胞系的构建，即介导含有验证元件的载体以单拷贝的形式整合到哺乳动物基因组转录活跃区，从而正常行使其验证Cre融合蛋白穿膜能力和生物学活性的功能。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于一种Cre融合蛋白功能检测细胞及修饰后的Cre融合蛋白，以验证Cre融合蛋白的穿膜效率和生物活性，从而优化Cre融合蛋白在相关基因工程领域的应用。本专利技术是通过以下技术方案来实现 —种Cre融合蛋白功能检测载体,包括Pcmv IE启动子,在Pcmv IE启动子的上游设有attB序列，Pcmv IE启动子的下游设有两个同向的Loxp序列,两个同向的Loxp序列之间依次设有BGH终止子、BGH终止子和SV40A终止子，Loxp序列的下游设有荧光标记基因及抗生素筛选基因；当Loxp序列及其之间的三个终止子在Cre重组酶作用下剪切后，PcmvIE启动子和荧光标记基因拼接，启动荧光标记基因的表达。所述的载体为pAcmv-stop-EGFP,包括以下元件及连接顺序attB序列-Pcmv IE启动子-Loxp序列-BGH终止子-BGH终止子-SV40A终止子-Loxp序列-荧光标记基因-抗生素筛选基因；所述的荧光标记基因为EGFP基因阅读框，抗生素筛选基因为neo，该载体称为载体。所述pAcmv-stop-EGFP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。一种Cre融合蛋白功能检测细胞，宿主细胞为HEK293细胞，将pAcmv-stop-EGFP载体和phiC31整合酶表达载体pCMVint共转染宿主细胞；利用G418抗性筛选阳性转染的重组细胞，并筛选其中attB-CMV-stop-EGFP表达载体以单拷贝的形式整合入宿主细胞假attP位点的细胞。所述的Cre融合蛋白功能检测细胞在检测Cre融合蛋白剪切活性中的应用。所述的Cre融合蛋白是具有蛋白转导功能的穿膜肽和核定位信号修饰的Cre融合蛋白。一种经TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白，从N端开始分别为6XHis区域、NLS多肽区域、TAT多肽区域和Cre酶区域；其中NLS多肽区域的氨基酸残基的序列为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val, AT 多肽区域的氨基酸残基的序列为Tyr-Gly-Arg-Lys_Lys—Arg-Arg-Gln—Arg-Arg-Argο所述的TAT和NLS多肽修饰的Cre融合蛋白的制备方法，具体步骤如下I) PCR扩增得到带有SacI和XhoI识别序列的Cre核苷酸序列，将扩增产物经过SacI和XhoI酶切后，回收连接到同样经过SacI和XhoI酶切的原核表达载体pET28a(+)上，得到pET28a-Cre重组质粒；2)由引物退火产生带有NdeI和SacI识别序列粘性末端的NLS-TAT核苷酸序列，并将其连接到经过NdeI和SacI酶切的pET28a_Cre重组质粒，得到pET28a_HNTC重组质粒;3)将pET28a_HNTC重组质粒转化到大肠杆菌BL21菌株中，挑选5_8个阳性的菌落接种在卡那霉素抗性的LB培养基中，在16 22°C用O. 2mM IPTG诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种Cre融合蛋白功能检测载体，其特征在于，包括Pcmv？IE启动子，在Pcmv？IE启动子的上游设有attB序列，Pcmv？IE启动子的下游设有两个同向的Loxp序列，两个同向的Loxp序列之间依次设有BGH终止子、BGH终止子和SV40A终止子，Loxp序列的下游设有荧光标记基因及抗生素筛选基因；当Loxp序列及其之间的三个终止子在Cre重组酶作用下剪切后，Pcmv？IE启动子和荧光标记基因拼接，启动荧光标记基因的表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余源，张涌，王勇胜，刘军，权富生，田进海，王易之，李仲夏，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，杨凌科元克隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：