本发明专利技术具体涉及一种ITR同向排列的AAV载体pSDAV2，该表达载体主要由两个同向排列的AAV2的ITR、筛选基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。将报告基因插入pSDAV2载体，筛选获得细胞株，利用“一个细胞株/一株辅助病毒”策略包装重组AAV病毒，发现ITR同向排列不仅能够明显提高包装获得重组AAV病毒中双链AAV病毒的比例，还能增强包装携带基因的体内外表达效率。总之，本发明专利技术提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体，为重组AAV病毒的包装特别是重组双链AAV病毒的包装提供了新的选择。
【技术实现步骤摘要】
ITR同向排列的AAV载体构建及其应用本专利技术属于生物技术专利
本专利技术具体涉及一种ITR同向排列的AAV载体PSDAV2，该表达载体主要由两个同向排列的AAV2的ITR、筛选基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。将报告基因插入PSDAV2载体，筛选获得细胞株，利用“一个细胞株/ 一株辅助病毒”策略包装重组AAV病毒，发现ITR同向排列不仅能够明显提高包装获得重组AAV病毒中双链AAV病毒的比例，还能增强包装携带基因的体内外表达效率。总之，本专利技术提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体，为重组AAV病毒的包装特别是重组双链AAV病毒的包装提供了新的选择。背景腺相关病毒(Adeno-associatedvirus, AAV)属于微小病毒科(Parvovirus),其基因组为一条单链DNA分子。AAV是依赖性病毒,需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疫病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将 整合到细胞染色体中成为潜伏状态,而不产生子代病毒。目前已发现多种AAV病毒，从基因组组成和血清学上可以分为不同的亚型(WuZJ, Asokan A, Samulski RJ. Adenoassociated virus serotypes vector toolkit forhuman gene therapy. Mol Ther, 2006,14 (3) :316-327.)。虽然不同的基因组亚型之间，核苷酸序列存在一定的差异，但不同亚型之间的基因组大小和结构是相似的。以AAV2为例，其基因组大小为4675nt,分为反向末端重复序列(Inverted terminal repeat, ITR)区、rep基因区和cap基因区。ITR区为基因组5’和3’末端两个长度为145nt的反向末端重复序列，包含AAV2基因组的复制起点，与AAV2复制、整合或包装等功能相关，为AAV2病毒基因组中的顺式作用元件。rep基因区和cap基因区为两个功能基因区，编码AAV2生活周期中需要的各种调节蛋白和结构蛋白，为AAV2产毒性复制提供各种反式作用因子。rep基因区编码AAV复制和病毒基因表达等所必需的调节蛋白，根据分子量大小的不同可分为R印78、R印68、R印52、R印40等4种形式。cap基因区编码3种结构蛋白，VP1、VP2、VP3，共同组装成AAV病毒的外壳。AAV是基因治疗的理想载体之一。大量的高质量的重组AAV(Recombinant AAV,rAAV)病毒的制备是AAV载体用于基因治疗的前提和基础。rAAV病毒制备的过程中主要解决的3个问题是，AAV载体质粒的设计和构建，各种反式作用因子(即RP和cap基因编码的各种蛋白)的反式提供和辅助病毒的选择和提供。针对这3个问题，不同的研究者提出了不同的解决方案，形成了多种rAAV病毒的制备系统。目前国际上普遍采用的是Xiao (XiaoX,Li J,Samulski RJ. Production of high—titer recombinant adeno-associated virusvectors in the absence of helper adenovirus. J Virol, 1998, 72 (3) :2224-2232.)等提出的三质粒共转染系统。这三个质粒分别为AAV载体质粒,rep-cap表达质粒和辅助质粒。三个质粒分别解决rAAV病毒制备过程中的3个问题。AAV载体质粒包含AAV2的两个ITR序列，且在两个ITR之间插入外源启动子、多克隆位点和polyA加尾信号序列，用于外源表达基因的克隆。rep-cap表达质粒通过编码和表达MV病毒产毒性复制的各种调节蛋白和结构蛋白，反式提供rAAV病毒包装过程中所需的各种因子。辅助质粒携带了 5型腺病毒的E2A、E40RF6和VA RNA基因，可替代腺病毒，为rAAV病毒的产毒性复制提供辅助功能。在国内rAAV病毒制备应用较为广泛的方法为两个中国专利(专利号98120033.8,99119038. 6)组合报道的“一种病毒感染一个载体细胞株”法系统。专利(专利号98120033. 8)报道了一种携带rep-cap基因表达框的I型单纯疱疫病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV1),这株病毒不仅具有辅助病毒的功能，还可以反式提供各种rAAV病毒产毒性复制所需的各种反式作用因子。专利(专利号99119038.6)则报道了一系列通用型腺相关病毒载体，应用这些载体可以构建稳定携带AAV载体的细胞株，将专利(专利号98120033.8)中的辅助病毒感染AAV载体细胞株，制备获得大量的rAAV病毒。这些rAAV病毒制备系统的提出促进了 AAV载体在基因治疗等领域中的应用。但由于AAV病毒本身基因组为单链DNA分子，因此AAV病毒进入细胞后，需要先合成其互补链才能开始携带的外源基因的表达，导致外源基因表达的延后和效率降低，限制了 rAAV载体的进一步应用。scrAAV(Self comp I ementary rAAV)载体制备系统的提出解决了这一问题。通过缺失AAV载体中一个ITR的TRS (Terminal resolution site)序列，导致Rep蛋白不能对缺失TRS的ITR进行切割，因此包装获得rAAV病毒携带两个正常的ITR、缺失d序列的ITR和完全互补的外源基因表达框的两条单链(在rAAV 5000nt包装容量允许的范围内)， 获得自身基因组可互补的rAAV(scrAAV)载体。scrAAV载体进入细胞后其基因组可以自身互补配对形成双链，不依赖于细胞合成其互补链，提高携带外源基因的表达速度和效率。虽然由于rAAV包装容量(不大于5000nt)的限制，scrAAV可携带的外源基因的表达框的大小不能大于2500bp,限制了 scrAAV载体对某些较大外源基因表达框的携带,但是scrAAV可以显著地提高外源基因的表达效率，降低其在基因治疗中的用量，因此scrAAV载体在基因治疗中，特别是以较小基因(如hFIX、siRNA、miRNA和核酶等)为导入基因的基因治疗中仍具有广泛的应用前景。而且，近年来一些较小高效的顺式作用元件(如启动子、加尾信号等)的出现，有效地降低了其在外源基因表达框中的所占容量，扩大了 scrAAV载体可携带外源基因的长度。由于R印蛋白不能完全识别并切割ITR中的TRS序列，因此当rAAV载体携带的外源基因表达框小于2500bp时，包装获得的rAAV载体也存在一定比例的scrAAV，但比例小于50%。为了提高包装获得rAAV载体中scrAAV的比例，常采用的策略是降低包装系统中的Rep蛋白表达量和对ITR中的TRS序列进行突变操作。在三质粒包装系统中，常采用将Rep基因的起始密码子由“ATG”突变为“ACG”和启动子远离R印基因的方法降低R印蛋白的表达水平。对ITR中TRS序列的突变操作则为对TRS序列中的D序列进行点突变和缺失突变，使R印蛋白不能识别。经过这些改造，利用三质粒包装系统获得scrAAV载体的比例可达90%以上。虽然降低Rep基因的表达水平可本文档来自技高网...
【技术保护点】
ITR同向排列的AAV载体，其技术特征在于：两个AAV2?ITR同向排列且ITR间包含一个外源基因表达框，用于外源基因的插入。
【技术特征摘要】
1.1TR同向排列的AAV载体，其技术特征在于两个AAV2 ITR同向排列且ITR间包含一个外源基因表达框，用于外源基因的插入。2.如权利要求1所述，该载体可用于重组AAV病毒的制备，且明显提高重组AAV病毒中scrAAV(Self complementary rAAV)的比例，scrAAV 比例达到 60% 以上。3.如权利要求2所述，包装获得rAAV病毒可明显提高外源基因在体内外的表达强度。4.如权利要求1所述，外源基因表达框中的启...
【专利技术属性】
技术研发人员：董小岩，田文洪，吴小兵，董哲岳，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。