携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的AAV载体、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供一系列携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的重组腺相关病毒。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达截短的抗肌萎缩蛋白，降低动物模型血液中的肌酸激酶，恢复其肌肉功能。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为新的杜氏肌营养不良症治疗药物。

AAV vector carrying truncated gene expression frame of dystrophin, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
携带截短抗肌萎缩蛋白基因表达框的AAV载体、制备方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及重组腺相关病毒载体携带人为设计的截短的抗肌萎缩蛋白基因表达框的杜氏肌营养不良症基因药物。
技术介绍
Duchenne型肌营养不良(Duchennemusculardystrophy，DMD)是一种由抗肌萎缩蛋白基因的致病性变异所导致的X染色体连锁隐性遗传性肌病，其致病基因简称为DMD基因（dystrophinmusculardystrophygene，DMD）。DMD基因是人类最大的基因之一，位于Xp21，编码dystrophin蛋白，即抗肌萎缩蛋白。该基因在基因组序列上跨越了2.5Mb，占全部基因组序列长度的0.1%，占X染色体全长的1.5%，该基因99%的序列由内含子组成，编码区包括79个外显子及7个组织特异性的启动子，其mRNA序列长14kb，主要表达于骨骼肌、心肌，少量表达于脑组织。约60%～65%的DMD/BMD（Beckermusculardystrophy，Becker型肌营养不良）患者是由于DMD基因中一个或多个外显子的缺失突变而致病，且缺失突变存在两个热区（外显子45～54和外显子3～22）；重复型突变约占5%～10%，主要发生在3～11和21～37外显子区域，与缺失热区有部分重叠；其余的30%为点突变或微缺失。与缺失突变不同，点突变没有显著的分布热点，随机地分布于整个基因上，根据目前DMD基因突变统计结果，所有的外显子都有发现微小突变或点突变，通常导致无义突变和移码突变，内含子区域的点突变也会导致选择性剪切、外显子跳跃等，引起疾病。全长dystrophin是一个很大的杆状蛋白，主要有四个结构域：1个N端结构域，24个重复序列，4个铰链区，1个富含半胱氨酸的结构域和1个C端结构域。1号铰链区和4号铰链区分别在24个重复序列的两端，2号和3号铰链区分布在24个重复序列的中间。N端结构域主要结合细胞骨架上的F肌动蛋白，CR结构域和CT结构域通过dystrophin相关蛋白复合物而锚定在细胞膜上，中间一大部分是24个三重螺旋的杆状重复和四个铰链区H，即centralroddomain。该病的发病率在存活男婴中为1/5000(1/3599～1/9337)(ScheuerbrandtG.MuscleNerve.2018;57(2):185-188.MoatSJ,etal.EurJHumGenet.2013;21(10):1049-1053.MahJK,etal.NeuromusculDisord.2014;24(6):482-491.MendellJR,etal.AnnNeurol.2012;71(3):304-313.)，中国大陆为1/4560(KeQ,etal.WorldJPediatr.2017;13(3):197-201.)。DMD基因的致病性变异引起多种抗肌萎缩蛋白亚型的异常表达，肌肉亚型的阴性表达或显著下降导致了肌营养不良的发生发展，表达于脑组织、心肌、视网膜、肾脏、周围神经等组织的多种亚型的异常表达(MuntoniF,etal.LancetNeurol.2003;2(12):731-740.PillersDA,etal.NatGenet.1993;4(1):82-86.LidovHG,etal.HumMolGenet.1995;4(3):329-335.ByersTJ,etal.NatGenet.1993;4(1):77-81.)，导致部分患者还伴有其他器官系统的受累表现，出现认知功能受损、行为障碍、消化功能障碍以及心肌病等(RicottiV,etal.DevMedChildNeurol.2011;53(1):12.RicottiV,etal.EurJHumGenet.2016;24(4)：562-568.)。根据患者肢体无力的表现以及伴随的其他器官系统损害，DMD病情进展可分为五个阶段，分别是症状前期、早期独走期、晚期独走期、早期不能独走期以及晚期不能独走期(BushbyK,etal.LancetNeurol.2010;9(1):77-93.BirnkrantDJ,etal.LancetNeurol.2018;17(3):251-267.BrookeMH,etal.MuscleNerve.1983;6(2):91-103.MazzoneE,etal.Neurology.2011;77(3):250-256.RicottiV,etal.JNeurolNeurosurgPsychiatry.2016;87(2):149-155.)症状前期：多数患者出现运动发育迟缓（WangDN,etal.NeuromusculDisord.2017;27(8):715-722.），可伴有不同程度的静止性精神发育迟滞或认知功能受损，爬、独走的时间较同龄儿延迟，跑步慢，不能连续跳跃，腓肠肌开始出现肥大；部分患者平卧位坐起困难。早期独走期：患者一般在5岁前发病，多数从3～4岁开始出现肢体无力的症状与体征，进入该期。表现为上台阶费力、蹲起费力、跑步缓慢、Gowers’征阳性、下蹲后足跟不能着地、腓肠肌肥大以及双膝腱反射减弱或消失。在运动功能的上升期，患者的病情相对稳定，并有一定的提升，随后出现平台期；此后，行走姿势异常，摇摆呈鸭步，腰椎开始前凸，跟腱挛缩，踮脚尖走路。晚期独走期：一般7岁后病情进展加速（BrookeMH,etal.MuscleNerve.1983;6(2):91-103.LiW,etal.NeuromusculDisord.2015;25(5):375-380.），进入该期。临床特点是不能上楼梯，不能完成Gowers’征，不能跑步，跟腱挛缩加重；部分患者可出现膝关节挛缩，少数患者可能出现髋关节的半脱位或脱位（ChanKG,etal.JPediatrOrthopB.2001;10(3):219-225.）。早期不能独走期：患者下肢肌力继续下降，通常在9～10岁丧失独立行走能力（VryJ,etal.JNeuromusculDis.2016;3(4):517-527.EagleM,etal.NeuromusculDisord.2002;12(10):926-929.MendellJR,etal.ArchNeurol.1987;44(8):808-811.），少数患者在8岁前丧失独立行走能力（HumbertclaudeV,etal.EurJPaediatrNeurol.2012;16(2):149-160.BelloL,etal.Neurology.2016;87(4):401-409.McDonaldCM,etal.MuscleNerve.2013;48(1):32-54.），进入该期。患者还可以短距离扶行、独坐或扶站，髋关节出现半脱位或脱位（ChanKG,etal.JPediatrOrthopB.2001;10(3):219-225.），膝关节挛缩加重，肘关节开始挛缩，出现脊柱侧弯，腓肠肌逐渐萎缩。晚期不能独走期：通常在14～15岁后不能独坐，双上肢活动开始受限，进入该期。开本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种截短的人抗肌萎缩蛋白基因的表达框，其特征在于，/n（Ⅰ）包含肌肉特异性启动子序列；/n（Ⅱ）含有优化的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的编码序列；/n（Ⅲ）携带人miRNA靶序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种截短的人抗肌萎缩蛋白基因的表达框，其特征在于，
（Ⅰ）包含肌肉特异性启动子序列；
（Ⅱ）含有优化的截短的人抗肌萎缩蛋白基因的编码序列；
（Ⅲ）携带人miRNA靶序列。


2.如权利要求1所述的肌肉特异性启动子，具体为SEQIDNO.2序列和/或SEQIDNO.3序列和/或SEQIDNO.4序列。


3.如权利要求1所述的优化的截短的人抗肌萎缩蛋白基因编码序列，序列信息见SEQIDNO.5。


4.如权利要求1所述的人miRNA靶序列，具体为人miR-122的完全互补的靶序列。


5.重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框或权利要求2、3、4要求序列的组合。


6.如权利要求5所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11