一种AAV1病毒介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途制造技术

本发明专利技术提供一种肌肉组织特异性表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK）以降低高血脂、延缓衰老和提高生殖能力的基因表达和转移载体。所述载体含有改造后的人α‑骨骼肌肌动蛋白（α‑skeletal actin）基因的启动子、鼠细小病毒（minute virus of mice,MVM）的内含子、改造后的人PCK1（phosphoenolpyruvatecarboxykinase 1,PCK1）基因的cDNA和4个串联的人miR‑122靶序列。所述重组载体由腺相关病毒载体介导，包括但不限于1型腺相关病毒。

【技术实现步骤摘要】
一种AAV1病毒介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种AAV1病毒载体介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途，包含该载体的重组表达单元及基因治疗方式。
技术介绍
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（phosphoenolpyruvatecarboxykinase,PEPCK）是催化糖异生（gluconeogenesis）反应的一个限速酶，即由草酰乙酸和GTP转变为磷酸烯醇式丙酮酸、GDP及CO2的反应。三羧酸循环是在线粒体中进行，PEPCK则有两种同工酶，分别是在线粒体中的PEPCK-M（mitochondrialform）和在胞浆中的PEPCK-C（cytosolicform）。PEPCK-C基因在人里叫PCK1，在糖异生中有重要作用。目前PCK1已成为肝脏糖异生的第一个明确标志物，肝脏中该基因的转录水平是临床上2型糖尿病评价的重要指标，即如果PCK1的mRNA表达水平增加，糖异生的速率就一定会增加。PCK1基因编码了一个63kD的蛋白酶，其功能主要有三个方面：在肝脏和肾皮质中表达，催化糖异生反应；在肝脏以及白色和棕色脂肪组织中表达，参与甘油异生反应（glyceroneogenesis）；在流失反应（cataplerosis）中起作用，去除三羧酸循环中的阴离子以便大大增加三羧酸循环的动力学。然而PCK1在不同组织中的转录活性不同。除了主要存在于肝脏中，PCK1同时还广泛存在于哺乳动物的组织内，包括小肠、结肠、乳腺、肾上腺、肺和肌肉，但是在这些组织中的代谢作用还不明确。除此之外，PCK1在不同组织中的主要功能也不同，所以在不同组织中特异性条件敲除或过表达PCK1将引起多种不同的表型。正常情况下，PCK1在骨骼肌中不表达或表达量很低。PCK1用6个ATP的能量来催化丙酮酸转变为一个葡萄糖，而在骨骼肌的无氧酵解过程中，每分解一个葡萄糖却只能生成2个ATP。甘油三酯在骨骼肌中的含量与PCK1成正比，是主要的能量来源。在肌肉中过表达PEPCK-C的转基因小鼠（PEPCK-Cmus）有着令人兴奋的表型。首先，PEPCK-Cmus转基因小鼠的运动能力远远高于对照小鼠，能以20米/分钟的速度跑5公里，而对照小鼠在同样速度下只能跑0.2公里，这可能与骨骼肌里甘油三酯的增加有关。其次，PEPCK-Cmus转基因小鼠的寿命远远长于对照小鼠，而且在30-35个月时还能产下正常的小鼠后代，大多数小鼠在12-18个月就失去生殖能力了（HakimiP1,YangJ,CasadesusG,etal.Overexpressionofthecytosolicformofphosphoenolpyruvatecarboxykinase(GTP)inskeletalmusclerepatternsenergymetabolisminthemouse.JBiolChem.2007;282(45):32844-32855.）。在骨骼肌中过表达PEPCK-C的转基因猪也得到了和小鼠类似的结果。得到了一种和顶级牛肉特性类似的、低脂肪含量高肌间脂肪含量的猪肉，在肉质和口感上获得大幅度提升，具有巨大的经济价值。并且PEPCK-C转基因猪在繁殖能力上有所提高，因此在优良品种的繁殖上有着广泛的应用前景。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus,AAV）载体作为一类新型的安全载体，其重要性正被研究者逐渐认识到。它是细小病毒家族成员，为无包膜的线性单链DNA病毒，具有广泛的宿主范围，既能感染分裂细胞又能感染非分裂细胞，并能介导外源基因的长期表达。作为病毒载体的重要一员，AAV不具有明显的细胞毒性效应，并且不会像其他病毒载体那样引起细胞强烈的免疫反应；同时在构建重组AAV病毒时，完全缺失AAV病毒自身的编码序列而仅保留其两端长度为145bp的末端重复序列（invertedterminalrepeat，ITR），从而有效降低其重组和表达自身蛋白的可能性，使安全性得到进一步提高。因此，AAV作为一种理想的基因治疗载体，正在越来越多地引起人们兴趣和关注（LuY.Recombinantadeno-associatedvirusasdeliveryvectorforgenetherapy-areview.StemCellsDev.2004;13(1):133-145;DalyTM.Overviewofadeno-associatedviralvectors.MethodsMolBiol.2004;246:157-165.）。不同血清型的AAV对不同组织的感染能力略有差异，其中AAV1对骨骼肌的感染能力很好（RebuffatA,etal.ComparisonofAdeno-AssociatedVirusPseudotype1,2,and8VectorsAdministeredbyIntramuscularInjectionintheTreatmentofMurinePhenylketonuria.HumGeneTher.2010;21(4):463-477.），可采用直接多点注射目的骨骼肌的方式进行有效感染。如前所述，在正常生理状态下，PCK1主要存在于肝脏中，因而可依此设计高表达低毒性的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体。在正常生理状态下骨骼肌中高表达人的α-骨骼肌肌动蛋白，因此可选用该基因的启动子，并添加MVM的内含子来提高转录效率以实现PCK1在骨骼肌中的特异性高表达。并且对启动子序列进行了点突变，消除序列中的XhoI和SalI酶切位点。之后连接PCK1的cDNA序列，并根据密码子简并性原理，对PCK1基因的CDS序列进行点突变，消除其中的EcoRI和BglII酶切位点。同时为了降低外源导入PCK1基因在肝脏中的表达，在PCK1基因终止密码子后又引入4个串联的人肝脏中高表达的miRNA——miR-122的碱基完全互补靶序列，抑制导入PCK1基因在肝脏中的表达，避免病毒经由血液循环进入肝脏中表达PCK1过高所可能引起的毒性。因此，将改造后的人α-骨骼肌肌动蛋白基因的启动子、MVM内含子、改造后的PCK1基因的cDNA和4个串联miR-122的靶序列组合起来，并用AAV1靶向运输骨骼肌的重组表达载体系统是一种能够实现骨骼肌特异性表达PCK1的良好方法，在治疗高脂血症、延缓衰老和提高生殖能力上有广阔的应用前景。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种AAV1病毒载体介导的骨骼肌特异性PCK1基因表达载体及其用途，包含该载体的重组表达单元及基因治疗方式。该重组基因表达载体和病毒能有效降低血脂水平从而达到治疗高脂血症的目的。与此同时还兼具延缓衰老和提高生殖能力的功能。本专利技术提供的重组病毒是有生物学活性的，有希望成为同时治疗高脂血症、延缓衰老和提高生殖能力的候选病毒。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种重组载体表达单元，其特征在于，包括：（1）如SEQIDNo.1所示的人α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列；和/或（2）如SEQIDNo.2所示的鼠小病毒MVM内含子的核苷酸序列；和/或（3）如SEQIDNo.3所示的人PCK1基因的cDNA序列；和/或（4）如SEQIDNo.4所示的4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组载体表达单元，其特征在于，包括：（1）如SEQ ID No.1所示的人α‑骨骼肌肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列；和/或（2）如SEQ ID No.2所示的鼠小病毒MVM内含子的核苷酸序列；和/或（3）如SEQ ID No.3所示的人PCK1基因的cDNA序列；和/或（4）如SEQ ID No.4所示的4个串联的人miR‑122靶序列。

【技术特征摘要】
1.一种重组载体表达单元，其特征在于，包括：（1）如SEQIDNo.1所示的人α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的核苷酸序列；和/或（2）如SEQIDNo.2所示的鼠小病毒MVM内含子的核苷酸序列；和/或（3）如SEQIDNo.3所示的人PCK1基因的cDNA序列；和/或（4）如SEQIDNo.4所示的4个串联的人miR-122靶序列。2.根据权利要求1所述的重组载体表达单元的构建方法，其碱基全序列如SEQIDNo.5所示。3.根据权利要求1和权利要求2所述的重组载体表达单元，其特征在于，具有：（Ⅰ）、如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；或（Ⅱ）、如SEQIDNo.5所示的核苷酸序列的互补序列；或（Ⅲ）、与（Ⅰ）或（Ⅱ）的核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11