一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物制造技术

本发明专利技术提供一种重组腺相关病毒介导的用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的ApoC2基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达载脂蛋白C2，显著降低血液中甘油三酯的含量并使其恢复正常，有效延长仓鼠生存期。结果提示，该重组腺相关病毒载体基因药物可用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎。

A gene drug for the treatment of severe hypertriglyceridemia

【技术实现步骤摘要】
一种用于治疗严重高甘油三酯血症的基因药物
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带人miR-142-3p靶序列的ApoC2基因表达框，为用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物。
技术介绍
高甘油三酯血症（hypertriglyceridemia，HTG）是一种异族性甘油三酯蛋白合成或降解障碍，临床表现为“血稠”，即血液中脂质含量过高导致的血液黏稠，在血管壁上沉积，渐渐形成小斑块，即动脉粥样硬化。根据病因可将高甘油三酯血症分为原发性与继发性，原发性高甘油三酯血症包括家族性高甘油三酯血症、家族性混合型血脂异常、家族性异常β-脂蛋白血症等；继发性高甘油三酯血症的病因主要包括代谢性疾病、某些疾病状态、激素和药物等。高甘油三酯血症是我国急性胰腺炎（acutepancreatitis，AP）的第二大病因，称之为高甘油三酯血症性急性胰腺炎（hypertriglyceridemiaacutepancreatitis，HTG-AP）。近几年，高甘油三酯血症性急性胰腺炎的发病率逐年上升，其以显著的血甘油三酯（TG）值升高，代谢紊乱和多脏器功能障碍为主要特征。该病的致病因素复杂，确切的发病机制尚不清楚，可能与TG水平升高，分解产生游离脂肪酸（FFA）增多导致对胰腺本身的毒性和化学刺激作用、胰腺微循环障碍、基因突变和氧化应激等有关。早期降低血TG是该病治疗的核心，血浆置换和血液滤过、结合中医中药治疗是目前常用的治疗方法（付静.天津药学.2017;29(2):57-60）。对于继发性高甘油三酯血症（糖尿病、甲减、药物、高脂饮食等）诱发的HTG-AP患者，针对原发病进行治疗控制甘油三酯是减少HTG-AP复发的关键，同时运动、饮食干预、减重、降脂药物等方法均有控制甘油三酯的确切效果（ValdivielsoP,etal.EuropeanJournalofInternalMedicine.2014;25:689-694.）。然而，对于基因缺陷型HTG-AP患者，使用贝特类药物、烟酸类药物及Ω-脂肪酸均无法有效降低血浆甘油三酯水平，且无法降低HTG-AP的发病率（BlackettP,etal.JournalofClinicalLipidology.2013;7:132-139.StefanuttiC,JuliusU.AtherosclerSuppl.2015;18:85-94.）。目前已明确LPL、LMF1、ApoC2、GPIHBP1、ApoA5等基因缺陷患者均可致重度原发性高甘油三酯血症及HTG-AP反复发病（Coca-PrietoI,etal.BmcGastroenterology.2009;9:46.GotodaT,etal.JournalofAtherosclerosis&Thrombosis.2012;19:1.），因此基因疗法具有很好的应用前景。对于LPL基因缺陷的HTG患者，Stroes等（StoresES,etal.ArteriosclerThrombVascBiol.2008;28(12):2303-2304.）通过运用含有LPL基因的病毒载体治疗，可减轻其餐后乳糜微粒血症，从而降低胰腺炎的发病率。Gaudet等（GaudetD,etal.GeneTher.2013;20(4):361-369.）对14例LPL基因缺陷型HTG-AP患者应用AAV1-LPLS447X进行基因治疗（肌肉注射），患者血浆甘油三酯在12周下降到40%，经过2年临床观察无HTG-AP复发和严重不良反应。饮食中的甘油三酯（TG）以乳糜微粒（CM）的形式与肝脏合成的TG形成极低密度脂蛋白（VLDL）而在血液中运输。它们被周围组织毛细血管内皮的脂蛋白脂酶（LPL）所水解。LPL分布在脂肪组织、心肌和骨骼肌等组织，并在这些组织的实质细胞内合成，然后从细胞内分泌出来，转移到毛细血管内皮朝向管腔的表面上。这个酶的任何缺陷，都能使富含TG的脂蛋白（CM、VLDL）的代谢和清除发生异常，继而导致高甘油三酯血症，而LPL的活性受载脂蛋白C的调节。脂蛋白中的蛋白质部分称为载脂蛋白或脱脂蛋自（apoprotein或简写为apo-），它们是由60~250个氨基酸残基组成的多肽。目前已经发现的有8种载脂蛋白，主要有ApoA、ApoB、ApoC、ApoD以及含精氨酸和谷氨酸的载脂蛋白（ARP或称ApoE）五类。其中ApoA和ApoC又分若干亚类ApoA-I、ApoA-II；ApoC-I、ApoC-II和ApoC-III（朱赓伯.苏州医学院学报.1983;1:38-40）。人载脂蛋白CII（ApoCII/ApoC2）是由79个氨基酸组成的蛋白质，主要在肝脏和小肠中合成，分泌入血后参与组成乳糜微粒、极低密度脂蛋白和高密度脂蛋白（HDL）。ApoCII基因定位于19q13.2，与ApoE、ApoCII、ApoCIV形成一载脂蛋白基因簇（ApoE/CI/CIV/CII）。ApoCII与ApoE、ApoCI基因的结构非常相似，均由3个内含子、4个外显子组成。内含子的分布位置几乎相同：第一个内含子截断5’非翻译区，第二个内含子截断信号肽的编码区、靠近信号肽的切割部位，第三个内含子截断编码成熟蛋白质的区域。ApoC2为LPL的辅助因子，它可激活多种来源的LPL。其激活机制可能是：LPL通常存在于外周循环与肝素样分子结合，并附着于血管内皮上。当LPL接触乳糜微粒（CM）或极低密度脂蛋白（VLDL）时，LPL便同脂蛋白颗粒表面的磷脂发生作用进而结合于脂蛋白颗粒上。ApoC2羧基端44-79位氨基酸残基能与LPL羧基端389-448位氨基酸残基特异性交联，使LPL充分发挥脂解活性；进一步的研究发现ApoC2第55-78位氨基酸残基是维持其对LPL激活作用的最短必需肽段，第44-50位氨基酸残基为α螺旋结构与脂质结合区。ApoC2与LPL发生作用，改变LPL的空间结构，进而催化水解甘油三酯（高纯.国外医学临床生物化学与检验学分册.2000;21(6):285-286.）。对于ApoC2基因缺失的原发性HTG，目前尚没有特异性的治疗方法，可以输入ApoC2、新鲜血浆、ApoC2模拟肽治疗，但需要反复给药，因此理论上基因治疗才是可以彻底治愈该类HTG患者的最佳疗法。然而，目前还没有ApoC2的小鼠敲除模型，只有ApoC2的突变体模型，ApoC2高表达但分布在HDL上，而不在VLDL和乳糜微粒上，且只有中度HTG（500mg/dL），与人类的严重HTG完全不同，且不会发生或加重AP。仓鼠ApoC2敲除后和人类表型相似，甘油三酯特别高，且与LPL基因敲除救治后的HTG模型不同在于，其出生后的死亡是通过静脉注射血浆救活的，离乳后体内没有ApoC2的残余，成年和新生期的ApoC2敲除仓鼠都是理想的动物模型，因为人类的治疗可以从新生儿开始，也可以从成人开始。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.HogganMD,eta本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物，其特征在于，包括：/n（1）该基因药物由病毒载体携带；/n（2）该基因药物携带载脂蛋白C2的基因表达框。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗严重高甘油三酯血症及其合并症急性胰腺炎的基因药物，其特征在于，包括：
（1）该基因药物由病毒载体携带；
（2）该基因药物携带载脂蛋白C2的基因表达框。


2.根据权利要求1所述载脂蛋白C2的基因表达框，其特征在于，包括：
（1）如SEQIDNo.1所示的启动子序列；和/或
（2）如SEQIDNo.2所示的优化的载脂蛋白C2编码区的核苷酸序列；和/或
（3）如SEQIDNo.3所示的人miR-142-3p的靶序列；和/或
（4）如SEQIDNo.4所示的BGHpolyA序列；和/或
（5）如SEQIDNo.5所示的TGBenhancer增强子序列。


3.根据权利要求1和权利要求2所述的基因表达框，其碱基全序列如SEQIDNo.6所示，其特征在于，表达框表达产物为载脂蛋白C2，可降低血液中甘油三酯水平和抑制免疫反应。


4.根据权利要求1所述病毒载体，其特征在于，携带如权利要求1、权利要求2和权利要求3所述的基因表达框。


5.根据权利要求1和权利要求4所述的病毒载体，其特征在于，包括：
（1）该病毒载体包括但不限于腺相关病毒载体；和/...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11