一种高脂血症的基因治疗药物制造技术

本发明专利技术提供一种重组腺相关病毒介导的高脂血症治疗药物。重组腺相关病毒载体携带包含人miR‑142‑3p靶序列的oFat‑1（optimized Fat‑1，简称oFat‑1）基因表达框。体内实验表明，该重组腺相关病毒载体能够高效地导入体内，持续稳定地表达Fat‑1蛋白，提高体内ω‑3多不饱和脂肪酸含量，降低总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白含量。结果提示，该重组腺相关病毒载体有希望开发成为一种新的高脂血症治疗药物。

【技术实现步骤摘要】
一种高脂血症的基因治疗药物
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种重组腺相关病毒载体携带oFat-1基因表达框的高脂血症基因治疗药物。
技术介绍
高脂血症是由体内脂质代谢紊乱导致血脂水平增高而引起的一种病症，即血液中一种或多种脂质成分异常增高并由此引发一系列临床病理表现的病症。通常情况下，血清总胆固醇检测>5.72mmol/L，三酰甘油检测>2.3mmol/L，就可以被诊断为高脂血症。我国的血脂异常患病率高达18.6%，大约2亿人，对人们的健康造成了极大的危害。这是因为高脂血症是许多疾病的主要危险因素。首先高脂血症是形成冠心病的主要危险因素之一。高脂血症对身体的直接损害是加速全身动脉粥样硬化，因为全身的重要器官都要依靠动脉供血、供氧，一旦动脉被粥样斑块堵塞，就会导致严重的后果。大量研究资料表明，高脂血症与脑卒中、心肌梗死、心脏猝死、糖尿病、高血压、脂肪肝等的发病有着密切关系，是形成冠心病的主要危险因素之一。此外，高脂血症还可诱发胆结石、胰腺炎，加重肝炎，导致男性性功能障碍、老年痴呆症等疾病。最新研究提示高脂血症可能与癌症的发病有关。其次，高脂血症还是引起的心脑血管疾病的重要原因之一。近年来，随着人们生活习惯特别是饮食习惯的改变等多种因素的影响，高脂血症引起的心脑血管疾病的发病率呈现出明显增高的趋势。高脂血症引起的心脑血管疾病危害大，病情进展凶险，其死亡率约占人类总死亡率的半数左右。据现代医学疾病监控的数据显示，全世界每天因高脂血症引发的心脑血管疾病死亡人数近4000人之多。高脂血症严重地危机人们的健康和生命。虽然目前市面已有多种可用的高脂血症治疗药物，但都存在各自的弊端，仍然不能有效地惠及广大患者。他汀类药因其疗效确切，是目前主要的高脂血症临床用药。它通过抑制胆固醇合成限速酶羟甲戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA，HMG-CoA）还原酶活性，降低血液中的胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）和甘油三酯含量，并提高血液中的高密度脂蛋白含量，从而到达治疗高脂血症的目的。遗憾的是，对重症高脂血症病人，简单地提高他汀类药物的使用量，对LDL的降低作用有限，但却大大增加了肌痛肌炎等不良反应，患者依从性明显降低。而且有的高脂血症患者为他汀类药物不耐受者。针对这些不足，也研发出了或正在其他一些高脂血症治疗药物，如贝特类药物、烟酸及其衍生物、中药降脂药、PCSK9抑制剂（如PCSK9抗体、反义核苷酸等），但要么疗效相比于他汀类药物未见明显优势，要么使用成本极高，让很多的高脂血症望而却步。因此有必要研究新的更加高效的高脂血症治疗药物。Harris对70多个临床实验进行汇总分析证实：富含ω-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfattyacid，PUFA）的鱼油可以有效降低甘油三酯（triglyceride，TG）水平且疗效持久（HarrisWS.Lipids1999;34Suppl:S257-S258）。严重高脂血症患者每天服用鱼油4g可以使TG的含量下降25-30%，长期服用小剂量2g/d即有显著降低，餐后TG水平尤其敏感。BuneaR等研究发现高脂血症病人服用鱼油后能够显著降低体内的总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白（LDL）含量，同时提高高密度脂蛋白（HDL）含量，治疗作用明显（BuneaR,etal.AlternMedRev.2004;9(4):420-428.）。在欧洲，鱼油已经被批准用于高脂血症的治疗。这些结果都说明了ω-3PUFA在高脂血症中的治疗作用。后续的研究表明，通过服用鱼油提高体内的ω-3PUFA含量，降低ω-6PUFA/ω-3PUFA的比值，能够改变体内的脂代谢过程中的某些关键环节。如减少肝脏TG的合成和极低密度脂蛋白（VLDL）的分泌关系等。遗憾的是，人类自身不能够合成ω-3PUFA，需要从食物中吸收或人为补充ω-3PUFA，才能使体内的ω-6PUFA/ω-3PUFA保持在一个合理的水平。但大部分的饮食结构决定了每天摄入的PUFA多为ω-6PUFA。就算人为服用ω-3PUFA能够降低ω-6PUFA/ω-3PUFA，但体内的ω-6PUFA的绝对含量也相对较高。因此如果能够通过某种物质直接将体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，从而使ω-6PUFA的绝对含量和ω-6PUFA/ω-3PUFA比值均降低，无疑将具有更好的治疗效果。已有研究表明通过转基因方式将秀丽线虫中的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA的n-3PUFA脱氢酶（Fat-1）基因人源化（mFat-1）后，导入小鼠，制备得到Fat-1基因转基因小鼠，结果转基因小鼠体内的ω-3PUFA含量显著提高，ω-6PUFA含量明显降低，ω-6PUFA/ω-3PUFA比值降低（KimEH,etal.BiochemPharmacol.2012;84(10):1359-1365.）。该结果从原理上证明了Fat-1能够将哺乳动物体内的ω-6PUFA转化为ω-3PUFA。那么是否能够将Fat-1基因直接导入人体内，把ω-6PUFA转化为ω-3PUFA，显著降低ω-6PUFA/ω-3PUFA比值，从而达到治疗高脂血症的目的，开发出一种新的高脂血症治疗药物，仍然有许多困难需要克服。其中，最主要的障碍是，mFat-1基因本身不在人体内表达，作为一种异源蛋白，人体可能会产生针对表达Fat-1蛋白的免疫反应，直接对导入mFat-1基因并表达Fat-1蛋白的细胞进行免疫攻击。为了突破这一障碍，我们在本专利技术中设计了一种用于高脂血症的基因治疗药物rAAV-CAM-oFat-1-142T。为了提高Fat-1基因的表达效率，我们对Fat-1基因进行了序列优化合成，得到oFat-1基因。采用人为设计的高效表达启动子CAM调控oFat-1基因表达，并在基因的3’UTR（untranslatedregion）区加入miR-142-3p靶序列，最大限度地抑制oFat-1基因在免疫相关细胞（如抗原呈递细胞）中表达，显著降低针对oFat-1蛋白免疫反应的产生概率[29]。选择更加安全的重组AAV载体[30]携带oFat-1基因表达框。进一步提高了药物开发成功的可能性。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.HogganMD,etal.ProcNatlSciUSA.1966;55:1467-1474.）。AAV是微小病毒科(Parvovirus)成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA(RoseJA,etal.ProcNatlAcadSciUSA.1969;64:863-869.)，其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒(GeoffroyMC,etal.CurrGeneTher.2005;5(3):265-271.)，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态(ChioriniJA,etal.CurrTopMicrobio本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种秀丽线虫ω‑3不饱和脂肪酸转化酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；（Ⅱ）表达框表达产物能够以细胞内的ω‑6多不饱和脂肪酸为底物，催化转化为ω‑3多不饱和脂肪酸。

【技术特征摘要】
1.一种秀丽线虫ω-3不饱和脂肪酸转化酶基因表达框，其特征在于，（Ⅰ）包含SEQIDNo.1和SEQIDNo.3或SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；（Ⅱ）表达框表达产物能够以细胞内的ω-6多不饱和脂肪酸为底物，催化转化为ω-3多不饱和脂肪酸。2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因表达框。3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：（I）携带基因组可自我互补形成双链DNA分子；和/或（II）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，董小岩，吴小兵，马思思，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11