本发明专利技术公开一种治疗乙肝的基因药物及其制备方法，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。本发明专利技术基因药物所表达的Cas9蛋白在sgRNA的引导下针对HBV的cccDNA进行剪切，进一步破坏cccDNA，进而达到清楚HBV的目的，解决目前的HBV治疗方法无法根除HBV的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因药物领域，尤其涉及。
技术介绍
肝炎(Hepatitis)是肝脏的炎症，常常由病毒感染而引起。其中，病毒性肝炎又可以分为甲、乙、丙、丁和戊型，虽然病毒种类不同，但都足以对人构成严重危害，其中乙型和丙型肝炎可以导致肝硬化和肝癌的发生，给患者和家庭带来严重的疾病负担。尤其是乙型肝炎(HepatitisB)在我国分布极为广泛。据权威统计表明我国的乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染率约60%_70%，乙肝表面抗原携带率约占总人口的7.18%，以此估算，全国约有9300万人携带乙肝病毒，其中慢性乙型肝炎患者约2000万人。另据世界卫生组织的权威统计表明，全球有20多亿人曾受到过乙型肝炎病毒感染，大约3.5亿至4亿人罹患慢性HBV感染，在亚洲和非洲发病率尤其高。乙肝的发病机制至今尚未完全明确，一般认为与机体免疫功能低下，感染HBV后出现免疫应答或免疫调节功能紊乱，导致肝脏损伤有关，进而进一步可能发展为肝硬化及肝癌等。国内外尚无满意的治疗方法及特效药物，目前对于乙肝而言，主要有几个途径来控制，包括接种乙肝疫苗、药物治疗及其他治疗方式。乙肝疫苗对于防止HBV感染具有重要的作用，是目前全世界防止HBV的主要手段之一，然而，乙肝疫苗对于已经感染HBV的患者没有任何作用。因此，药物治疗是目前治疗已经感染HBV的患者的主要手段，包括干扰素、胸腺肽、核苷类药物、非核苷类药物、多肽类药物、治疗性疫苗以及中草药等。干扰素主要包括IFN-α，其是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，作用机制是通过与肝细胞膜受体结合，激活靶细胞抗病毒蛋白基因，切断病毒mRNA，抑制病毒蛋白的翻译。胸腺肽主要是指为一种人工合成的含28个氨基酸的多肽，具有较强的免疫调节作用，可增加T细胞前体和IL-2高亲和力受体的数量，促进IL-2生成，利于机体清除HBV。核苷类药物包括替比夫定和恩替卡韦等，主要作用靶点是RNA病毒的逆转录酶或DNA病毒的DNA聚合酶，其主要是模拟天然核苷的结构，竞争性作用于酶活性中心，嵌入正在合成的病毒DNA链中，终止病毒DNA链的延长，从而抑制病毒复制。非核苷类药物包括膦甲酸钠为代表的焦磷酸类似物等，具有一定的治疗潜力。多肽类药物包括硫普罗宁和还原型谷胱甘肽，前者是国内临床常用的肝功能改善剂和代谢解毒剂，具有疗效确切、安全、毒性小的特点，后者对于治疗急性肝炎和药物性肝损害中ALT、血清胆红素(SB)等指标可使之较为迅速地恢复正常。治疗性疫苗是指能打破慢性感染者体内免疫耐受、重建或增强免疫应答的新型疫苗，主要包括蛋白或多肽疫苗、DNA疫苗、免疫佐剂等，其主要是以诱导细胞免疫应答为主，是抗病毒、抗肿瘤新的治疗手段，具有费用低、安全、疗效好的特点，但目前仍处于探索阶段。中草药在乙肝治疗中显示出较好的前景，目前，治疗乙肝的中药品种很多，治疗效果和安全性都很高，主要包括苦参碱、氧化苦参碱磷脂复合物、齐墩果酸、水飞蓟宾等，其作用机制主要有抗病毒作用，调节免疫作用以及保肝作用。乙肝的其他治疗方式主要包括RNA干扰技术(RNAinterfere, RNAi)以及臭氧自血疗法。RNAi技术实际上是一种基因治疗疗法，经过精心设计的RNAi能够有效地控制HBV的复制，目前RNAi技术治疗乙肝在细胞水平和动物水平显示出了较好的效果，在人体中还需要进一步研究。臭氧自血疗法即通过臭氧及其活性代谢产物诱导人体产生免疫细胞，清除肝炎病毒;其次，臭氧还可诱导人体产生多种细胞因子，如各种内源性干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等，最终利用自身的免疫系统杀灭病毒感染细胞，使肝炎病毒的复制得到抑制，从而延缓和阻止病毒性肝炎的发展。然而，不管是药物治疗还是基于其他方法的治疗，目前对于HBV感染都是没有办法根治的，只能进行一定的控制。因此，目前的治疗乙肝的方法效果非常有限，亟待开发新的用于治疗HBV的药物。因此，现有的治疗肝硬化的技术还有待改进和开发。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供，旨在解决现有技术无法直接治疗乙肝的问题。。本专利技术的技术方案如下: 一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述载体包括:质粒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、附加体质粒载体、慢病毒载体以及转座子载体。所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述sgRNA序列包括:目标序列，gRNA骨架序列以及终止信号序列。所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述目标序列包括:Seq-TargetUSeq-Target2、Seq-Target3、Seq_Target4、Seq-Target5、Seq-Target6、Seq_Target7、Seq-Target8、Seq_Target9、Seq-Target 10，所述目标序列按5 ’_3 ’ 方向如下:Seq-Targetl:GACTTCTCTCAATTTTCTAG；Seq-Target2:GGCATAGCAGCAGGATGAAG；Seq-Target3:GCTGCCAACTGGATCCTGCG；Seq-Target4:GAAGCGAAGTGCACACGGTC；Seq-Target5:GTTGATAGGATAGGGGCATT；Seq-Target6:GCCTGCTAGGTTTTATCCAA；Seq-Target7:CCTCCAAGCTGTGCCTTGGG；Seq-Target8:TAAAGAATTTGGAGCTACTG；Seq-Target9:GGGTTGCGTCAGCAAACACT；Seq-TargetlO:TCCTCTGCCGATCCATACTG。所述的一种治疗乙肝的基因药物，其中，所述Cas9序列经过密码子优化，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示。所述的治疗乙肝的基因药物的制备方法，其中，包括步骤: A、构建重组载体-Cas9质粒:采用EcoR V和Not I对载体进行双酶切，将酶切后的载体与合成的Cas9序列按照摩尔比例1:10混合，再加入T4 DNA连接酶buff er溶液，制得重组载体-Cas9质粒； B、重组载体_Cas9质粒的转化:将重组载体-Cas9质粒向感受态DH5a细菌中转化，阳性克隆质粒即为测序鉴定好的携带有表达Cas9蛋白的重组载体-Cas9质粒； C、合成U6-Target_gRNA-CMV序列:首先针对HBV的cccDNA设计出Target革El序列，再将合成的U6序列、gRNA骨架序列以及驱动Cas9表达的CMV启动子序列与Target靶序列连接起来形成U6-Target-gRNA_CMV序列； D、构建重组载体-U6-Target-gRNA-CMV-Cas9质粒:采用BamHI和EcoR I对载体_Cas9质粒进行双酶切，然后将酶切后的载体_Cas9质粒与合成并退火的U6-Target-gRNA-CMV序列按照摩尔比例1:10混合，在加入T4 DNA连接酶buffer溶液，最终制得重组载体-U6-Target-gRNA_CMV_Cas9 质粒本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种治疗乙肝的基因药物，其特征在于，所述药物是由载体、U6启动子以及表达Cas9蛋白的序列元件和表达sgRNA的序列元件组成，所述载体用于装载U6启动子、Cas9序列和sgRNA序列并使其在细胞中表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈光风，史秀娟，刘小青，
申请(专利权)人：苏州佰通生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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