本发明专利技术涉及PP2A基因，尤其涉及PP2A拮抗剂在制备促进机体肝脏再生的药物中的应用。本发明专利技术发现PP2A基因敲除小鼠肝脏再生能力明显加强；在正常肝细胞LO2上，实验发现通过SiRNA的方法抑制PP2A的表达可以显著增强正常肝细胞LO2的增殖。本发明专利技术首次公开了PP2A基因和蛋白的拮抗剂可以用于制备促进肝脏再生的药物，在肝脏保护和再生药物领域具有潜在、良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及PP2A基因，尤其涉及PP2A在制备促进机体肝脏再生的药物中的应用。
技术介绍
肝脏是机体最大的实质性器官，与机体代谢、储存、消化W及解毒等功能密切相 关。研究表明肝脏不同于其他器官，具有很强的再生能力，使得机体在肝细胞程序性死亡的 情况下，可W维持肝脏的正常功能。 在严重肝病时，如酒精肝、脂肪肝W及重型肝炎导致的纤维化甚至肝硬化和肝癌 中，肝脏功能减退，体内有毒物质就会蓄积，进一步加重肝脏损害。肝移植术是目前治疗终 末期肝病和肝脏机械损伤的重要技术，然而由于供体紧缺、免疫排斥等问题使得大量的肝 病患者无法获得及时有效的治疗。即使可W得到有效的治疗，移植的百分比，切除的技术 等也会对肝脏功能再生造成很大影响。因此肝脏再生的研究具有很重要的临床意义，但是 由于肝脏的代偿性修复的相关基因与其作用机制尚未明了，导致了其广泛应用于临床的困 难。 蛋白磯酸酶2A(p;rotein地OS地atase2A，PP2A)是磯酸化的丝氨酸/苏氨酸残基 蛋白磯酸酶家族中十分重要的一员，它和PPl调节了细胞内几乎90%的蛋白丝氨酸/苏氨 酸的磯酸化。因此PP2A的生物活性可能是通过调节蛋白磯酸化的水平和持续时间来对细 胞代谢、DNA复制、基因表达、信号转导、细胞周期、细胞分化W及调亡等生命活动过程进行 调节。但是由于磯酸酶不具有特异性，可调节多种生命活动，因此无法构建简单的全敲除 模型进行研究，导致了 PP2A在某些生理活动中的作用难W明了。
技术实现思路
本专利技术首先考察正常小鼠在肝切除手术后肝再生的不同时期PP2A基因的表达水 平及相应蛋白的功能活性，猜测PP2A可作为肝脏移植中促进肝脏再生的潜在药物祀点。 为验证上述猜想，专利技术人建立了肝脏PP2AC a肝脏特异性敲除小鼠模型，验证特 异性PP2AC a敲除个体与野生型个体在肝脏损伤后代偿性修复的过程中肝脏的大小、功能 W及结构的影响。结果显示PP2Aca的敲除可W延迟肝再生的终止，促进肝细胞体积变大， 同时有利于损伤后肝脏功能的恢复。同时我们在体外肝细胞内利用小干扰RNA对PP2AC a 进行抑制，进一步验证了 PP2AC a可W促进肝细胞的增殖。 根据本专利技术的记载和本领域的公知常识，抑制肝脏PP2A活性可W促进肝脏再生。 因此PP2A基因重组表达载体可W单独或与其他有功能活性基因重组表达载体联合，再辅 W药学上可接受的载体，可W用W制备肝脏疾病治疗的药物。 此外，还可W用特异的PP2A基因编码的功能蛋白的干扰物质可W单独或与其他 具有功能活性的多肤、蛋白质、融合蛋白等联合，再辅W药物上可接受的载体，同样可W用 于制备肝脏疾病治疗的药物，提高患者的治疗效果及生命质量。【附图说明】 图1 PP2Aca敲除小鼠敲除效率的检测。提取对照小鼠和PP2Aca敲除小鼠的肝脏 总蛋白，免疫蛋白印记检测PP2AC a的表达。验证了 PP2AC a肝脏特异性敲除小鼠构建的 成功。 图2肝再生不同时期小鼠肝重体重比。*，与对照鼠相比，P < 0. 05 ;**，与对照鼠相比， P < 0. 01。显示了敲除小鼠在肝再生五天后再生速度明显大于对照小鼠 （n = 7-10)。 图3肝再生不同时期小鼠再生肝中有丝分裂相的统计。*，与对照鼠相比，P <0.05; **，与对照鼠相比，P < 0. 01。显示了敲除小鼠在肝再生4天后有丝分裂相明显高于和对照 小鼠 （n = 5) 图4肝再生不同时期小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的检测。**，与对照鼠 相比，P < 0. 01。显示了 PP2AC a敲除小鼠肝再生过程中血清中ALT和AST酶活性低于正 常小鼠，反映了 PP2AC a敲除有利于肝功能的恢复（n = 4-6)。 图5肝再生第五天肝细胞，细胞核大小的检测。*，与对照鼠相比，P < 0. 05 ;**，与对 照鼠相比，P <0.01。显示了 PP2AC a敲除小鼠有利于再生肝中肝细胞的增大（n = 7)。 图6 PP2AC a干扰腺病毒干扰效率验证。L02细胞接种于6孔板中，待细胞密度为60% 时更换无血清培养基，分别加入干扰和对照腺病毒，4小时后更换成正常培养基。病毒感染 48小时后收取细胞样，提RNA，定量PCR检测PP2AC a的表达。**，与对照比，P <0.01。 图7干扰PP2AC a后肝细胞增殖的检测。肝细胞接种于12孔板，分别感染PP2AC a干 扰和对照腺病毒后每隔24小时进行一次细胞计数。*，与对照比，P < 0. 05 ;**，与对照比， P <0.01。显示了在肝细胞中干扰PP2AC a可W促进肝细胞的增殖。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细的说明。 W下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术范围。实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南化W化rk ;Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例1建立PP2Aca肝脏特异性敲除小鼠 1) 材料： PP2AC a 小鼠由南京动物模式所高翔教授实验室构建并赠送，anti-PP2Ac a抗体购 自抓公司，anti-GAPDH抗体购自康成生物。 2) 敲除小鼠的获得： PP2Aca 与A化-ere (肝脏特异表达的Cre)交配，获得A化-cre-PP2Aca (即 PP2AC a +/ )，再与 PP2AC a 小鼠交配 W获 A化-cre-PP2Ac a 即 PP2AC a / 小鼠。 3) 敲除小鼠的鉴定： PP2Aca基因共有7个外显子，我们在实验中用到的PP2Aca敲除小鼠是缺失了外显子 3、4和5。我们首先利用Genotyping PCR对子代小鼠进行基因型鉴定，野生型的PCR产物 大小为59化P ;纯合子突变为70化P ;杂合子为590bp和70化P。然后选取PP2AC a敲除小 鼠、野生型小鼠和杂合子来验证敲除是否成功W及敲除的效率。我们在PP2AC a的第2和 7个外显子上设计上下游引物，进行PCR鉴定。正常小鼠能检测到87化P的PCR产物，而突 变小鼠由于缺失了第3~5个外显子，检测到的PCR产物比正常小鼠短，仅有45化p。 Genotyping中使用的PCR引物序列如下：我们用免疫蛋白印迹的方法检测PP2AC a的蛋白质表达，结果进一步证明了 PP2AC a 敲除小鼠具有较高的敲除效率。送些结果表明基因敲除小鼠的构建成功，可W用于后续的 实验。 实施例2 PP2AC a敲除效率鉴定 检测PP2Aca的敲除效率，我们提取了再生肝脏的总蛋白，具体方法如下： 取肝组织30mg，加入300 U L组织裂解缓冲液（其中含20mM his-肥1 PH7. 5 ;4mM EDTA ;2% SDS ;1. Ommol/L Na3V04 ;2. Ommol/L NaF ;100.0 y g/mL PMSF ;1. Oy g/血蛋白酶 抑制剂cocktail)，冰上匀浆后，4°C，12000巧m离必15min，收集上清夜于另一新EP管中， 进行Western印本文档来自技高网...
【技术保护点】
PP2A拮抗剂在制备促进肝脏再生药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：薛斌，李朝军，来珊珊，于紫涵，赵丹丹，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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