一种预防和治疗脉络膜新生血管相关眼部疾病的基因药物制造技术

本发明专利技术提供用于预防或治疗脉络膜血管新生相关的眼部疾病的组合物和方法，该组合物为包含VEGF抗体或其功能片段基因的重组载体表达单元和合适的腺相关病毒(adeno‑associated virus,AAV)外壳的重组病毒载体，其通过玻璃体腔或视网膜下注射可预防或治疗脉络膜血管新生相关的眼部疾病，如年龄相关黄斑变性和糖尿病视网膜病变等。

【技术实现步骤摘要】
一种预防和治疗脉络膜新生血管相关眼部疾病的基因药物
本专利技术涉及表达VEGF抗体的重组腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体在预防或治疗脉络膜血管新生相关的眼部疾病中的应用，如年龄相关黄斑变性和糖尿病视网膜病变等。
技术介绍
脉络膜新生血管（choroidalneovascularization，CNV)是多种眼部疾病的严重并发症，它能够引起眼底的组织出血、渗出及增生等一系列病理改变，因而造成眼球结构和功能的破坏，严重损害视功能。这一系列的眼底病变包括年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)、糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)和早产儿视网膜病等，严重影响视力，甚至致盲。年龄相关性黄斑变性是一种随年龄增加而发病率上升并导致中心视力下降的疾病，又称为老年相关性黄斑变性，是一种严重损害中心视力的眼病，以视觉极为敏感的视网膜黄斑区的退行性改变和新生血管生成为特征。临床上根据脉络膜有无新生血管伸入视网膜色素上皮下，而将AMD分为萎缩型（干性AMD）与渗出型（湿性AMD)。90%的AMD患者是干性AMD，是由氧化应激的损伤所致，可导致黄斑区组织萎缩变薄。10%的AMD患者是湿性AMD，由视网膜下的异常血管形成所致，主要病理表现为脉络膜病理性新生血管生长，这些新生血管渗液、渗血，从而导致中心视力下降，而且视力下降速度较快且严重。随着我国老龄化步伐的加快，湿性AMD致盲性眼病的发病人数呈逐年上升趋势，是老年人视力降低和致盲的主要眼病之一，在我国45岁以上人群中AMD发生率约5%，75岁以上人群中AMD发生率接近20%。糖尿病视网膜病变是糖尿病的严重并发症之一，致盲率高，也是后天致盲性眼病的重要原因之一。长期的高血糖环境会损伤视网膜血管的内皮，视网膜毛细血管受损后出现渗漏现象，造成周围组织水肿、出血，以及毛细血管闭塞，引起视网膜缺血、缺氧，并产生新生血管，从而导致视网膜大量出血与玻璃体内大量积血，出现增殖性玻璃体视网膜病变。研究认为VEGF在生理和病理的血管生成中都是必不可少的重要诱导因子，如能抑制VEGF的活性，可有效地控制新生血管的生成[1,2]。1990年代以来，以VEGF为靶标，通过阻断VEGF信号通路抑制眼底血管新生的药物成为开发的热点。兰尼单抗(FPFab01bizumab，商品名Lucentis)可特异性地结合VEGFA，已获美国FDA批准用于治疗湿性老年黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿[3]，临床结果显示，在应用兰尼单抗的患者中约95%有改善或稳定的视觉；VEGFTrap-Eye(阿柏西普或Eylea)是美国Regeneron制药公司开发的VEGF重组蛋白，临床研究结果显示对DME的疗效令人满意。KH902（康柏西普，Conbercept)是成都康弘公司开发的针对老年黄斑变性(AMD)的VEGFR-Fc重组蛋白，2013年12月批准上市用于治疗AMD[4]。另外，与兰尼单抗靶点相同但成分为全IgG1分子的药物贝伐单抗(Avastin,FPIG01cizumab)，目前只被FDA批准用于治疗结肠癌以及其他癌症，并不包括黄斑变性等眼底病。尽管如此，为了降低患者的经济负担，作为替代，很多眼科医师会超适应证使用贝伐单抗治疗视网膜相关的眼底病变，在一些临床前期和临床期试验中被证明和兰尼单抗疗效相当[5-10]。尽管针对VEGF靶标的药物在临床上取得了很大的进展，但眼内注射兰尼单抗，Elyea或KH902的费用都是非常昂贵的，而且这些药物面临着一个共同问题，即注射进体内的蛋白药物随着药物代谢会很快被清除掉，因此需要持续多次的眼内注射才能维持治疗效果。大多数情况下，须每4~8周重复给药一次。例如，兰尼单抗推荐每月给药1次或初始3个月连续每月注射1次给药之后，按每3个月注射给药1次。康柏西普推荐给药方案为：初始3个月，每个月玻璃体腔内给药1次，之后每3个月玻璃体腔内给药1次；或者在初始3个月连续每月玻璃体腔内给药1次后，按需给药。持续多次给药一方面增加医疗负担，另一方面多次玻璃体内注射给药也带来严重并发症如感染性眼内炎和视网膜脱落等的风险增加。针对血管新生相关的AMD和DR等疾病的现有疗法的局限性已在本领域中产生了对于经济可行的、持续更长的治疗策略的需求。AAV来自细小病毒家族，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。重组腺相关病毒载体(rAAV)是将AAV中的cap和rep基因替换成目标基因，目标基因不插入细胞的染色体中，以独立的染色体外DNA附加体的形式保留在细胞核中，在体内长期表达外源基因。由于AAV仅含衣壳蛋白和目标基因，因此安全性好、免疫源性低，而且AAV还具有宿主细胞范围广，能感染分裂和非分裂细胞等特点，成为现阶段在世界范围内应用最广的基因载体。Maguire（2008）等将AAV2-RPE65注射到3名LCAII患者的视网膜下腔，随访1年，患者视野有了显著改善，视觉敏感度得到持续而稳定的提高[11]。2016年8月份，AAV2-RPE65的3期临床试验结果发布，经AAV2-RPE65治疗一年后，93％（27/29）的患者功能性视力有所改善，并且基因治疗的疗效长达两年之久[12]。华中科技大学李斌等利用AAV2载体将ND4基因导入病人视网膜神经细胞用于治疗Leber遗传性视神经病变，在注射rAAV-ND4药物36个月后，9例接受治疗的病人中有6例表现出明显的视力改善[13]。AAV载体在眼科单基因遗传病中的临床应用提示我们利用AAV载体将VEGF抗体的基因导入眼内，有可能开发出一种新的治疗血管新生相关眼部疾病的基因治疗药物，这种基因治疗药物可以在眼内长期维持有治疗效果的抗体浓度，长期抑制眼部VEGF的活性，达到长效治疗老年相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等脉络膜血管新生相关的眼部疾病的效果。同时，由于这种基因治疗药物可以在体内长期表达，还可以起到预防疾病发生的作用。目前，从自然界已经分离出了12种血清型的AAV，得到的AAV突变型已达100多种。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而对不同组织细胞的侵染效率差异很大，表现出一定的器官靶向特异性。其中AAV2、AAV5、AAV8和AAV9对视网膜层细胞的感染能力很好[14,15]，可直接采用视网膜下腔或玻璃体内注射的方式进行有效感染[16]。鉴于以上背景，本专利技术提供了一种新的治疗血管新生相关眼部疾病的基因治疗药物及其用途，即利用AAV2、AAV5、AAV8和AAV9载体将VEGF抗体基因或其功能片段导入视网膜细胞层并实现高效表达。通过一次给药即可长期抑制眼部VEGF的活性，达到预防或长效治疗老年相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病等脉络膜血管新生（CNV)相关的眼部疾病的效果。
技术实现思路
本专利技术提供一种AAV载体介导的VEGF抗体基因表达载体及其用途，包含与该载体的组合物、重组表达单元及基因治疗方式。该重组病毒能长期有效表达VEGF全抗体或其功能片段，从而达到长期抑制眼部VEGF的活性，预防或长效治疗糖尿病视网膜病、老年相关性黄斑变性等脉络膜血管新生相关的眼部疾病的目本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组合物，所述组合物包括腺相关病毒外壳和表达VEGF抗体或其功能片段的重组载体表达单元。

【技术特征摘要】
1.一种组合物，所述组合物包括腺相关病毒外壳和表达VEGF抗体或其功能片段的重组载体表达单元。2.根据权利要求1所述组合物，其所用腺相关病毒外壳血清型为AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。3.根照权利要求1所述组合物，其重组载体表达单元的特征在于，包括：（1）含有结构组成为启动子-抗体或抗体功能片段基因-WPRE-polyA-增强子的表达单元；和/或（2）含有两个AAV2病毒的ITR序列。4.依据权利要求3所述重组载体表达单元，其抗体或抗体功能片段基因表达单元的特征在于，包括:（1）如SEQIDNo.1或SEQIDNo.2所示的CASS启动子的核苷酸序列；和/或（2）如SEQIDNo.3所示的抗体功能片段基因或SEQIDNo.4所示的抗体基因编码区的核苷酸序列；和/或（3）如SEQIDNo.9或SEQIDNo.10所示的氨基酸序列，但因遗传密码的简并性而与（...

【专利技术属性】
技术研发人员：余双庆，董小岩，田文洪，马思思，张著月，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11