改造后的HBV基因组和相关组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一系列改造后的HBV基因组及其对应的组合物。HBV基因组中含有siRNA表达单元，表达产生靶向HBV基因保守区的siRNA，降解天然HBV RNA。HBV基因组表达产生的类HBV基因组竞争性地抑制天然HBV基因组的包装。用高效转导肝脏的AAV载体携带改造后的HBV基因组，将其高效转运至体内肝细胞，可有效地抑制HBV病毒的复制和包装，从而达到治疗慢性乙肝的目的。

【技术实现步骤摘要】
改造后的HBV基因组和相关组合物及其应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一系列改造后的HBV基因组及其对应的组合物，并将其应用于慢性乙肝的基因治疗药物的开发。
技术介绍
乙肝是由HBV病毒感染引起的肝损伤性疾病。HBV属嗜肝DNA病毒科，是已知最小的感染人类的DNA病毒，基因组大小仅为3.2kb左右（WillH,etal.PrincessTakamatsuSymp.1982;12:237-247.）。同大多数包膜病毒一样，HBV病毒的生活周期主要包括黏附、胞吞、脱壳、复制、包装和分泌等过程（DandriM,etal.Gut.2012;61(Suppl1):i6-i17.）。目前，对病毒的基因组成、复制、包装、分泌等过程都了解得比较清楚。但由于缺乏简单易得的HBV体外感染细胞模型，HBV感染的早期机制如HBV的黏附、胞吞、脱壳等过程尚未得到阐明。HBVcccDNA在HBV病毒生活周期中处于核心地位。它既能转录产生表达HBV各种蛋白的mRNA，还能转录得到HBV的前基因组RNA（pregenomicRNA,pgRNA），作为逆转录形成HBV基因组DNA的模板（PerriS,etal.JVirol.1996;70:6803-6809.KiddAH,etal.NucleicAcidsRes.1996;24:3295-3301.）。此外，它还随细胞基因组复制而复制，保证了其在肝细胞中长期存在（ChongCL,etal.JBiomedSci.2011;18:96.）。HBV感染肝脏后对肝细胞无直接的损伤作用，其造成的病理损害主要是它复制所激发的免疫反应所致。免疫反应的强弱，尤其是细胞免疫应答的程度决定了HBV感染的转归。在急性HBV感染中，HBV特异的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxiclymphocyte,CTL）反应是多克隆的、强烈的（SprengersD,etal.JHepatol.2006;45:182-189.），而在慢性HBV感染中，CTL反应则是非常弱的，甚至测不到（BertolettiA,etal.JExpMed.1994;180:933-943.）。然而，由于缺乏合适的HBV感染动物模型，特别是HBV慢性感染动物模型，现有的研究结果仍未完全阐明HBV感染转归与不同程度的T细胞反应之间的因果关系。虽然如此，已有的研究结果表明CTL反应和体液免疫都在控制HBV感染中发挥重要作用（GuidottiLG,etal.AnnuRevPathol.2006;1:23-61.ChisariFV,etal.PatholBiol(Paris).2010;58:258-266.）。CTL反应能够有效地抑制感染HBV肝细胞中HBV的复制，在少数情况下还能够杀死感染HBV的肝细胞（PhillipsS,etal.JImmunol.2010;184:287-295.）；体液免疫能够阻断HBV病毒感染新的肝细胞（GolsazShiraziF,etal.JGastroenterolHepatol.2014;29:1083-1091.）。两种免疫反应相互协作，共同清除HBV病毒。两种免疫反应都应在病毒清除过程中保持一定的强度，确保病毒的有效清除。根据HBV的致病机制和自身特点，已有和正在研发的乙肝治疗药物主要分为两大类。一类直接作用于HBV生活周期的某一阶段，阻断其进程，降低体内的HBV病毒载量，达到治疗的目的。该类药物主要包括抑制HBVDNA聚合酶功能的各种核苷酸类似物（AnandAC,etal.TropGastroenterol.2008;29:71-75.）、影响生活周期其他阶段的小分子物质（CampagnaMR,etal.JVirol.2013;87:6931-6942.）以及针对HBV基因的siRNA（XieQ,etal.ActaVirol.2012;56:49-55.）等。另一类则是以免疫反应为基础，试图打破HBV在肝脏中诱导产生的免疫耐受，增强机体对HBV病毒的清除作用，主要包括细胞因子（JostS,etal.JVirol.2007;81:10588-10596.）、治疗性疫苗（MichelML,etal.MedMicrobiolImmunol.2015;204:121-129.）、天然免疫增强剂（MenneS,etal.JHepatol.2015;pii:S01688-8287(14)00955-6.）等。现有的乙肝治疗药物主要有核苷酸类似物、干扰素和聚乙二醇化干扰素等（WangXY,etal.WorldJGastroenterol.2014;20:7707-7717.）。虽然这些药物的应用有效地控制了HBV的流行，但其都存在一定的不足之处，如长期使用出现耐药性、副作用较大等。而且它们对慢性乙肝患者的HBsAg转归率较低，对大多数患者只能缓解病情进程而不能治愈疾病。为了改进现有药物存在的不足之处，多家制药公司又设计开发多种治疗HBV的候选药物（WangXY,etal.WorldJGastroenterol.2014;20:7707-7717.），正处于临床前和临床研究阶段。RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是一种近年来获得迅猛发展的新的基因阻断技术，具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地阻抑特定基因的表达（ZhouY,etal.NucleicAcidsRes.2002;30:1664-1669.）。而且HBV的基因组重复利用率高，一段基因组序列常常被多个编码蛋白反复多次利用（BichkoV,etal.FEBSLett.1985;185:208-212），靶向基因组中特定序列的siRNA往往能够干扰多个编码蛋白的表达。因此基于siRNA的治疗药物具有广阔的开发前景。直接使用合成siRNA面临着大规模制备成本高、合成的siRNA稳定性差半衰期短、患者需要反复给药以及如何应用有效的给药方式等一系列的技术难题。针对化学合成siRNA的不足之处，我们拟对HBV基因组进行改造，保留HBV基因组中基因组复制、病毒包装和基因表达所必须的序列，通过缺失、移码突变等方式使HBV各种蛋白无法表达，得到改造后的HBV基因组，即类HBV基因组。在此基础上，设计并合成多个基因组拷贝的类HBV基因组，同时在多个基因组拷贝的类HBV基因组中引入两个靶向HBV的siRNA基因表达单元。然后用高嗜肝性的AAV载体携带含有siRNA基因表达框的类HBV基因组，通过病毒感染高效转导肝细胞表达产生类HBV前体基因组RNA和靶向HBV的siRNA序列，在HBV病毒的包装、病毒基因组复制和蛋白表达等多个阶段阻断HBV病毒的生活周期，显著降低体内的HBV病毒载量，从而开发出一种治疗乙肝的基因药物。腺相关病毒（Adeno-associatedvirus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（AtchisonRW,etal.Science.1965;149:754-756.HogganMD,etal.ProcNatlSciUSA.1966;55:1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（RoseJA,etal.ProcNatlAcadSciUSA.19本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一系列改造后的HBV基因组，其特征在于，包括：（1）不表达产生组成HBV病毒颗粒的各种蛋白； 和/或（2）基因组中存在0.1至0.3个拷贝的重复序列；和/或（3）含有两个靶向HBV病毒保守序列的干扰RNA表达结构。

【技术特征摘要】
1.一系列改造后的HBV基因组，其特征在于，包括：（1）不表达产生组成HBV病毒颗粒的各种蛋白；和/或（2）基因组中存在0.1至0.3个拷贝的重复序列；和/或（3）含有两个靶向HBV病毒保守序列的干扰RNA表达结构。2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因序列。3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：（1）体内外转导可表达产生改造后的HBV基因组DNA；和/或（2）体内外转导可表达产生靶向HBV的干扰RNA，抑制HBV蛋白的表达；和/或（3）重组腺相关病毒载体血清型包括但...

【专利技术属性】
技术研发人员：田文洪，马思思，董小岩，吴小兵，
申请(专利权)人：北京五加和分子医学研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11