寡核苷酸组合物及其使用方法技术

本公开尤其提供了设计的寡核苷酸、组合物及其方法。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸组合物提供了改善的单链RNA干扰和/或RNA酶H介导的敲低。本公开尤其涵盖以下认识：寡核苷酸的结构元件，诸如碱基序列、化学修饰(例如，糖、碱基和/或核苷酸间键联的修饰)或其样式、与附加的化学部分的缀合和/或立体化学[例如，主链手性中心的立体化学(手性核苷酸间键联)]和/或其样式，可对寡核苷酸的性质和活性例如RNA干扰(RNAi)活性、稳定性、递送等具有显著影响。在一些实施方案中，本公开提供了使用所提供的寡核苷酸组合物(例如在RNA干扰和/或RNA酶H介导的敲低中)治疗疾病的方法。

Oligonucleotide composition and method of use

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡核苷酸组合物及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2017年6月2日提交的美国临时申请号62/514,769、2017年6月2日提交的美国临时申请号62/514,771、2018年4月12日提交的美国临时申请号62/656,949、2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,686以及2018年5月11日提交的美国临时申请号62/670,709的优先权，所述临时申请各自以引用的方式整体并入本文。
技术介绍
靶向基因的寡核苷酸可用于各种应用，例如治疗性应用、诊断性应用、研究应用和纳米材料应用。天然存在的核酸(例如未修饰的DNA或RNA)的使用可以例如因它们易受核酸内切酶和核酸外切酶影响而受到限制。
技术实现思路
本公开尤其涵盖了以下认识：控制寡核苷酸的结构元件，诸如化学修饰(例如，糖、碱基和/或核苷酸间键联的修饰)或其样式、立体化学(例如，主链手性核苷酸间键联的立体化学)或其样式的改变和/或与附加的化学部分(例如脂质部分、靶向部分、碳水化合物部分、与脱唾液酸糖蛋白受体或ASGPR结合的部分，例如GalNAc部分)等的缀合，可对寡核苷酸的性质和/或活性产生重大影响。在一些实施方案中，所述性质和/或活性包括但不限于参与指导例如由RNA干扰(RNAi干扰)、单链RNA干扰(ssRNAi)、RNA酶H介导的敲低、翻译的空间位阻等介导的基因或其基因产物的表达、活性或水平的降低。在一些实施方案中，本公开证明包含具有受控的结构元件的寡核苷酸(并且特别是单链寡核苷酸)的组合物提供了意料不到的性质和/或活性。在一些实施方案中，本公开涵盖了以下认识：立体化学，特别是主链手性中心的立体化学，可以出乎意料地改善寡核苷酸的性质。许多先前的观察结果是一些增加稳定性的结构元件也可以降低活性，例如RNA干扰，与之相反，本公开证明立体化学的控制可以令人惊讶地增加稳定性而不会显著降低活性。在一些实施方案中，本公开提供了用于在保持或增加活性的同时改善寡核苷酸稳定性的技术(例如化合物、方法等)，其包括稳定性改善的寡核苷酸的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了具有某些5′-末端结构的寡核苷酸。本公开尤其证明了此类寡核苷酸可以具有所需的性质。在一些实施方案中，本公开提供了在根据本公开使用时可以提供具有高生物学活性(例如RNAi活性)的寡核苷酸的5′-末端结构。文献已报道，在许多情况下，RNAi活性要求存在5′-磷酸(或修饰的磷酸)部分；在一些实施方案中，本公开证明，令人惊讶的是，具有未修饰的5′-末端(即，具有5′-OH)的寡核苷酸可以得到与包含5′-磷酸(或修饰的磷酸)部分的其他方面相同寡核苷酸可比的RNAi活性。因此，在一些实施方案中，本公开尤其提供了其序列针对RNAi靶位点的寡核苷酸，所述寡核苷酸可包含对RNAi活性有用的(或无害的)一个或多个其他结构特征，如本文所述和/或本领域中其他文献已知的，其中所述寡核苷酸具有5′-OH部分。在一些实施方案中，本公开涵盖了以下认识：各种附加的化学部分，诸如脂质部分和/或碳水化合物部分，在掺入寡核苷酸中时，可以改善一种或多种寡核苷酸性质，诸如靶基因或其基因产物的敲低。在一些实施方案中，附加的化学部分是任选的。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含多于一个附加的化学部分。在一些实施方案中，寡核苷酸可包含两个或更多个附加的化学部分，其中所述附加的化学部分是相同或不同的，或属于相同的类别(例如，靶向部分、碳水化合物部分、与ASPGR结合的部分、脂质部分等)或不属于相同的类别。在一些实施方案中，某些附加的化学部分促进寡核苷酸向所需细胞、组织和/或器官的递送。在一些实施方案中，某些附加的化学部分促进寡核苷酸的内化和/或增加寡核苷酸的稳定性。在一些实施方案中，本公开提供了用于将各种附加的化学部分掺入寡核苷酸中的技术。在一些实施方案中，本公开提供了例如用于通过核碱基掺入附加的化学部分(例如，通过共价连接，任选地经由接头，掺入到核碱基上的位点)的试剂和方法。在一些实施方案中，本公开证明了用其结构包含本文所述的一个或多个特征的寡核苷酸可以实现令人惊讶的高靶标特异性。在一些实施方案中，本公开提供了实现等位基因特异性抑制的技术，例如寡核苷酸组合物及其方法，其中相对于同一基因的至少一个其他等位基因，选择性地敲低来自特定靶基因的一个等位基因的转录物。本公开尤其提供了可以掺入寡核苷酸中并且可以赋予或调节其一个或多个性质的结构元件、技术和/或特征(例如，相对于缺少相关技术或特征的其他方面相同的寡核苷酸)。在一些实施方案中，本公开记载可以将一种或多种所提供的技术和/或特征有效地掺入各种序列的寡核苷酸中。在一些实施方案中，本公开证明某些所提供的结构元件、技术和/或特征对于参与和/或指导RNAi机制的寡核苷酸(例如RNAi剂)特别有用。然而，无论如何，本公开的教义不限于通过任何特定机制参与或起作用的寡核苷酸。在一些实施方案中，本公开涉及可用于任何目的的任何寡核苷酸，所述寡核苷酸可通过任何机制起作用并且包含本文所述的任何序列、结构或格式(或其部分)。在一些实施方案中，本公开提供了可用于任何目的的寡核苷酸，所述寡核苷酸可通过任何机制起作用并且包含本文所述的任何序列、结构或格式(或其部分)，其包括但不限于任何5-′末端结构；5′-末端区域；第一区域(包括但不限于种子区域)；第二区域(包括但不限于种子后区域)；和3′-末端区域(其可以是3′-末端二核苷酸和/或3′-末端帽)；任选的附加的化学部分(包括但不限于靶向部分、碳水化合物部分、结合APGR的部分和脂质部分)；立体化学或立体化学样式；修饰或修饰样式；核苷酸间键联或核苷酸间键联样式；糖的修饰或糖的修饰样式；碱基的修饰或碱基的修饰样式。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以参与(例如，指导)RNAi机制。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以参与RNA酶H(核糖核酸酶H)机制。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以充当翻译抑制剂(例如，可以提供翻译的空间位阻)。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以参与外显子跳跃机制。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是适体。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以结合并抑制蛋白质、小分子、核酸或细胞的功能。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可参与在细胞中与双链核酸形成三链螺旋。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以与基因组(例如，染色体)核酸结合。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以与基因组(例如，染色体)核酸结合，从而防止或减少所述核酸的表达(例如，通过防止或减少转录、转录增强、修饰等)。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以与DNA四链体结合。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是免疫调节的。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是免疫刺激的。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是免疫刺激的，并且可以包含CpG序列。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是免疫刺激的，并且可以包含CpG序列，并且可以用作佐剂。在一些实施方案中，所提供的寡核苷酸可以是免疫刺激的，并且可以包本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含为单链RNAi剂的寡核苷酸的组合物，其中所述单链RNAi剂与靶RNA序列互补或基本上互补，/n具有约15至约49个核苷酸的长度，并且/n能够指导靶标特异性RNA干扰，/n其中所述单链RNAi剂包含至少一个非天然碱基、糖和/或核苷酸间键联。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170602 US 62/514,769;20170602 US 62/514,771;20181.一种包含为单链RNAi剂的寡核苷酸的组合物，其中所述单链RNAi剂与靶RNA序列互补或基本上互补，
具有约15至约49个核苷酸的长度，并且
能够指导靶标特异性RNA干扰，
其中所述单链RNAi剂包含至少一个非天然碱基、糖和/或核苷酸间键联。


2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是手性控制的寡核苷酸组合物，其包含特征在于以下的特定寡核苷酸类型的寡核苷酸：
a)共同的碱基序列和长度；
b)共同的主链键联样式；
c)共同的主链手性中心样式；
所述组合物是手性控制的，因为相对于具有相同的共同碱基序列和长度的寡核苷酸的基本上外消旋的制品而言，所述组合物富含所述特定寡核苷酸类型的寡核苷酸；并且
其中所述寡核苷酸与靶RNA序列互补或基本上互补；
具有约15至约49个核苷酸的长度；并且
能够指导靶标特异性RNA干扰。


3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含寡核苷酸的组合物，所述寡核苷酸是单链RNAi剂，
其中所述单链RNAi剂与靶RNA序列互补或基本上互补，
具有约15至约49个核苷酸的长度，
其中所述长度包括具有ababababab的2'-修饰样式的至少约10个连续核苷酸的跨度，其中a表示2'-修饰的第一类型，并且b表示2'-修饰的第二类型，其中每个第一类型可以相同或不同，并且每个第二类型可以相同或不同，并且每个第一类型与每个第二类型都不同，
并且其中所述单链RNAi剂能够指导靶标特异性RNA干扰。


4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个呈Sp构型的硫代磷酸酯。


5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含至少一个呈Rp构型的硫代磷酸酯。


6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中从所述寡核苷酸的5'-末端起包含任选取代的嘧啶核碱基的第一核苷酸包含手性核苷酸间键联，其将所述第一核苷酸与下一核苷酸连接。


7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述主链手性中心样式包括SpSpSpSpSp，其中每个Sp独立地表示包含Sp键联磷的手性核苷酸间键联。


8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述主链手性中心样式包括SpOSpO，其中每个Sp独立地表示包含Sp键联磷的手性核苷酸间键联，并且O表示天然磷酸二酯键联。


9.一种组合物，其是包含第一多个寡核苷酸的寡核苷酸组合物，所述第一多个寡核苷酸共享：
1)共同的碱基序列；
2)共同的主链键联样式；
3)共同的独立地在一个或多个手性核苷酸间键联(手性控制的核苷酸间键联)处的立体化学；
所述组合物是手性控制的，因为所述组合物中的所述第一多个寡核苷酸的水平是预定的。


10.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是如权利要求9所述的组合物。


11.如权利要求9或10所述的组合物，其中预定水平是所述组合物中全部寡核苷酸的(90％)n-100％的百分比，其中n是手性控制的核苷酸间键联的数目，并且n是5-25。


12.如权利要求9-11中任一项所述的组合物，所述组合物中的共享共同的碱基序列、共同的碱基修饰样式、共同的糖修饰样式和/或共同的修饰的核苷酸间键联样式的全部寡核苷酸是所述组合物中的全部寡核苷酸的至少90％。


13.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸包含任选地通过接头在核碱基处与所述寡核苷酸连接的碳水化合物部分。


14.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸包含任选地通过接头在核碱基处与所述寡核苷酸连接的脂质部分。


15.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是包含寡核苷酸的组合物，其中所述寡核苷酸包含其任选地通过接头在核碱基处与所述寡核苷酸连接的靶向部分。


16.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的寡核苷酸具有式O-I的结构：



或其盐，其中：
RE是5'-末端基团；
每个BA独立地是选自以下的任选取代的基团：C1-30脂环族、C6-30芳基、具有1-10个杂原子的C5-30杂芳基、具有1-10个杂原子的C3-30杂环基、天然核碱基部分和修饰的核碱基部分；
每个Rs独立地是-F、-Cl、-Br、-I、-CN、-N3、-NO、-NO2、-L-R'、-L-OR'、-L-SR'、-L-N(R')2、-O-L-OR'、-O-L-SR'或-O-L-N(R')2；
s是0-20；
每个L独立地是共价键，或者选自以下的二价的、任选取代的、直链或支链基团：C1-30脂族基团和具有1-10个杂原子的C1-30杂脂族基团，其中一个或多个亚甲基单元任选且独立地被以下替代：C1-6亚烷基、C1-6亚烯基、-C≡C-、-C(R')2-、-O-、-S-、-S-S-、-N(R')-、-C(O)-、-C(S)-、-C(NR')-、-C(O)N(R')-、-N(R')C(O)N(R')-、-N(R')C(O)O-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2N(R')-、-C(O)S-、-C(O)O-、-P(O)(OR')-、-P(O)(SR')-、-P(O)(R')-、-P(O)(NR')-、-P(S)(OR')-、-P(S)(SR')-、-P(S)(R')-、-P(S)(NR')-、-P(R')-、-P(OR')-、-P(SR')-、-P(NR')-、-P(OR')[B(R')3]-、-OP(O)(OR')O-、-OP(O)(SR')O-、-OP(O)(R')O-、-OP(O)(NR')O-、-OP(OR')O-、-OP(SR')O-、-OP(NR')O-、-OP(R')O-或-OP(OR')[B(R')3]O-；并且一个或多个碳原子任选且独立地被CyL替代；
每个CyL独立地是选自以下的任选取代的四价基团：C3-20脂环族环、C6-20芳基环、具有1-10个杂原子的5-20元杂芳基环和具有1-10个杂原子的3-20元杂环基环；
每个环A独立地是具有0-10个杂原子的任选取代的3-20元单环、双环或多环；
每个LP独立地是核苷酸间键联；
z是1-1000；
L3E是-L-或-L-L-；
R3E是-R'、-L-R'、-OR'或固体支撑体；
每个R'独立地是-R、-C(O)R、-C(O)OR或-S(O)2R；
每个R独立地是-H或选自以下的任选取代的基团：C1-30脂族、具有1-10个杂原子的C1-30杂脂族、C6-30芳基、C6-30芳基脂族、具有1-10个杂原子的C6-30芳基杂脂族、具有1-10个杂原子的5-30元杂芳基和具有1-10个杂原子的3-30元杂环基，或者
两个R基团任选且独立地一起形成共价键，或者：
同一原子上的两个或更多个R基团任选且独立地与所述原子一起形成任选取代的3-30元单环、双环或多环，其除了所述原子外还具有0-10个杂原子；或者
在两个或更多个原子上的两个或更多个R基团任选且独立地与它们的居间原子一起形成任选取代的3-30元单环、双环或多环，其除了所述居间原子之外还具有0-10个杂原子。


17.如权利要求1、2、3、9、10和13-16中任一项所述的组合物，其中所述组合物的寡核苷酸包含5'-末端基团RE，其中RE是-C(R5s)3、-L-PDB、-C(R5s)2OH、-L-R5s或-L-P5s-L-R5s或其盐形式，其中PDB是磷酸酯基团或者其衍生物或生物电子等排体。


18.如权利要求17所述的组合物，其中RE是-CH2OP(O)(OH)2或其盐形式。


19.如权利要求17所述的组合物，其中RE是-(E)-CH＝CH-PDB，其中PDB是磷酸酯基团或者其衍生物或生物电子等排体。


20.如权利要求17所述的组合物，其中RE是-(R)-CH(Me)-OH。


21.如权利要求17所述的组合物，其中RE是-(S)-CH(Me)-OH。


22.如权利要求17所述的组合物，其中包含RE的5'-核苷具有的结构或其盐形式，其中X是-O-或-S-，其中BA是选自以下的任选取代的基团：C1-30脂环族、C6-30芳基、具有1-10个杂原子的C5-30杂芳基、具有1-10个杂原子的C3-30杂环基、天然核碱基部分和修饰的核碱基部分。


23.如权利要求17所述的组合物，其中包含RE的5'-核苷具有的结构或其盐形式，其中X是-O-或-S-，其中BA是选自以下的任选取代的基团：C1-30脂环族、C6-30芳基、具有1-10个杂原子的C5-30杂芳基、具有1-10个杂原子的C3-30杂环基、天然核碱基部分和修饰的核碱基部分。


24.如权利要求22-23中任一项所述的组合物，其中X是O。


25.如权利要求22-24中任一项所述的组合物，其中BA是T。


26.如权利要求16-25中任一项所述的组合物，其中杂原子独立地选自氧、氮、硫、磷、硼和硅。


27.一种化合物，其是寡核苷酸的多聚体，其中每个寡核苷酸独立地是如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或化合物。


28.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的所述核苷酸间键联独立地是手性核苷酸间键联。


29.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的至少3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的所述核苷酸单元独立地包含2'-取代。


30.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的2'-取代是2'-F。


31.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的2'-取代是2'-OR1。


32.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的2'-取代是-L-，其中L连接糖单元的C2和C4。


33.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的至少3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或97％的所述核苷酸单元不包含2'-取代。


34.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸的所述主链手性中心样式包含(Sp)t(Rp)m(Sp)n，其中t和n中的每个独立地是2-50，并且m是1。


35.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸包含与靶序列完全互补的靶标结合序列，其中所述靶标结合序列的长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碱基，其中每个碱基是任选取代的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟苷、胸腺嘧啶或尿嘧啶，并且其中所述靶序列包含一个或多个等位基因位点，其中等位基因位点是SNP或突变。


36.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶序列包含两个SNP。


37.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述靶序列包含等位基因位点，并且所述靶标结合序列与疾病相关等位基因的靶序列完全互补，但不与所述疾病较少相关的等位基因的靶序列完全互补。


38.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述寡核苷酸是与在群体内存在多个等位基因的靶核酸序列的转录物结合的寡核苷酸，所述等位基因中的每个都含有特定的核苷酸特征序列元件，其相对于同一靶核酸序列的其他等位基因定义所述等位基因，
其中所述寡核苷酸的碱基序列是或包含与定义特定等位基因的所述特征序列元件互补的序列，
所述寡核苷酸的特征在于，当其与包含靶核酸序列的转录物的系统接触时，其表现出以大于针对同一核酸序列的另一个等位基因观察到的抑制水平的水平的对所述特定等位基因的转录物或由其编码的蛋白质的抑制。


39.一种用于降低转录物或由其编码的蛋白质的水平和/或活性的方法，其包括向表达所述转录物的系统施用如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物，其中所述寡核苷酸或所述组合物的寡核苷酸包含与所述转录物中的靶序列完全互补的靶向结合序列。


40.一种用于对在群体内存在多个等位基因的核酸序列的转录物进行等位基因特异性抑制的方法，所述等位基因中的每个都含有相对于同一靶核酸序列的其他等位基因定义所述等位基因的特定的核苷酸特征序列元件，所述方法包括以下步骤：
使包含所述靶核酸序列的转录物的样品与如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物接触，
其中所述寡核苷酸或所述组合物的寡核苷酸包含与所述核酸序列中的靶序列相同或完全互补的靶向结合序列，所述靶序列包含定义特定等位基因的特征序列元件，
其中当所述寡核苷酸或所述组合物的寡核苷酸与包含所述靶等位基因和同一核酸序列的另一个等位基因两者的转录物的系统接触时，以比针对所述同一核酸序列的另一个等位基因观察到的抑制水平更高的水平抑制所述特定等位基因的转录物。


41.一种用于对在群体内存在多个等位基因的核酸序列的转录物进行等位基因特异性抑制的方法，所述等位基因中的每个都含有相对于同一靶核酸序列的其他等位基因定义所述等位基因的特定的核苷酸特征序列元件，所述方法包括以下步骤：
向包含所述靶核酸序列的转录物的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的寡核苷酸或组合物，
其中所述寡核苷酸或所述组合物的寡核苷酸包含与所述核酸序列中的靶序列相同或完全互补的靶向结合序列，所述靶序列包含定义特定等位基因的特征序列元件，
其中当所述寡核苷酸或所述组合物的寡核苷酸与包含所述靶等位基因和同一核酸序列的另一个等位基因两者的转录物的系统接触时，以比针对同一核酸序列的另一个等位基因观察到的抑制水平更高的水平抑制所述特定等位基因的转录物。


42.如权利要求40-41中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·瓦格斯，N·岩本，D·C·D·巴特勒，S·马拉帕，陆根良，张敬新，V·瓦蒂帕迪卡尔，M·D·弗兰克卡梅内斯基，L·H·阿波尼，曺永镇，
申请(专利权)人：波涛生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG