经工程化为表达ADAR1的细胞和非人动物及其用途制造技术

除其他外，本披露提供了经工程化为表达ADAR1多肽或其特征性部分的细胞和非人动物。在一些实施例中，本披露提供了经工程化为表达人ADAR1多肽或其特征性部分的细胞和非人动物。在一些实施例中，非人动物是经遗传修饰的啮齿类动物，例如小鼠、大鼠等。在一些实施例中，非人动物是小鼠。在一些实施例中，本披露提供了用于评估药剂的技术，这些技术包括将该药剂施用于经工程化为表达ADAR1多肽或其特征性部分的细胞或非人动物。在一些实施例中，这样的细胞或非人动物经工程化为表达人ADAR1多肽或其特征性部分。在一些实施例中，药剂是药物制剂。在一些实施例中，药剂是或包含寡核苷酸。药剂是或包含寡核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经工程化为表达ADAR1的细胞和非人动物及其用途
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年8月24日提交的美国临时申请号63/069,698、2020年11月8日提交的63/111,072和2021年4月14日提交的63/175,031的优先权，其各自的全部内容通过引用并入本文。

技术介绍

[0002]寡核苷酸可用于多种应用，例如治疗、诊断和/或研究应用。例如，靶向多种基因的寡核苷酸可用于治疗与此类靶基因有关的病症、障碍或疾病。

技术实现思路

[0003]除其他外，本披露提供了经工程化为包含和/或表达ADAR1多肽或其特征性部分的细胞、胚胎和非人动物。在一些实施例中，胚胎和非人动物经工程化为包含和/或表达其序列编码ADAR1多肽或其特征性部分的多核苷酸。
[0004]在一些实施例中，细胞是啮齿类动物例如小鼠细胞。在一些实施例中，胚胎是啮齿类动物胚胎，例如小鼠胚胎。在一些实施例中，非人动物是啮齿类动物。在一些实施例中，其为大鼠。在一些实施例中，其为小鼠。
[0005]在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类(例如人)ADAR1多肽或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p110多肽或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p150多肽或其特征性部分。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p110肽。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含人ADAR1 p150肽。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物(例如人)ADAR1的一个或多个或所有以下结构域：Z
‑
DNA结合结构域、dsRNA结合结构域和脱氨酶结构域。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物(例如人)ADAR1Z
‑
DNA结合结构域中的一者或两者；替代性地或另外地，在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物(例如人)ADAR1 dsRNA结合结构域中的一者、两者或全部；替代性地或另外地，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含灵长类动物(例如人)脱氨酶结构域。在一些实施例中，灵长类动物(例如人)ADAR1多肽或其特征性部分可与非灵长类动物(例如啮齿类动物例如小鼠)ADAR1多肽或其特征性部分一起表达，例如一个或多个人dsRNA结合结构域可经工程化为与小鼠ADAR1脱氨酶结构域一起表达以形成人
‑
小鼠杂合ADAR1多肽。在一些实施例中，ADAR1多肽或其特征性部分是或包含非灵长类动物(例如啮齿类动物(例如小鼠))ADAR1，其中非灵长类动物ADAR1是经改造化使其一个或多个结构域被一个或多个相应的灵长类动物(例如，人)ADAR1结构域(例如，Z
‑
DNA结合结构域、dsRNA结合结构域和/或脱氨酶结构域)替换。
[0006]除其他外，提供的技术(例如细胞、胚胎、动物、方法等)可用于评估其活性可能与ADAR1相关的各种药剂。例如，在一些实施例中，所提供的技术作为动物模型特别有用，用于
评估/表征各种药剂，例如寡核苷酸及其组合物，用于核酸编辑、例如转录物中的腺苷编辑(例如A到I的转换)。除其他外，本披露包括这样的共识：可在多种人系统(例如，细胞)中提供编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)及其组合物可能在不含或不表达人ADAR1)的某些细胞(例如啮齿类动物细胞例如小鼠细胞)和某些动物诸如啮齿类动物(例如，小鼠)中不会显示出编辑或显示出低得多的编辑水平。特别地，小鼠(一种常用的动物模型)对于评估用于在人中编辑的多种药剂(例如，寡核苷酸)可能具有有限的用途，因为在人细胞中有活性的多种药剂在未经工程化为包含或表达适当的ADAR1(例如，人ADAR1)多肽或其特征性部分的小鼠细胞和动物中不提供或提供非常低水平的活性(参见图22
‑
26，野生型(WT)小鼠和细胞、人细胞以及经工程化为表达hADAR1 p110的细胞和小鼠(huADAR小鼠)的数据)。在一些实施例中，本披露提供了经工程化为表达ADAR1多肽或其特征性部分(例如，人ADAR1 p110、p150等)的细胞和非人动物(例如，啮齿类动物诸如小鼠)，以及它们用于评估/表征编辑剂(诸如各种寡核苷酸)及其组合物的用途。除其他外，此类工程化的细胞和/或动物与未如此工程化的细胞和/或动物相比可展示出与人细胞中的活性更相关和/或更可预测人细胞中的活性的活性。
[0007]在一些实施例中，工程化的细胞、胚胎、非人动物等都是经遗传修饰的。在一些实施例中，工程化的细胞、胚胎、非人动物包含多核苷酸，其序列编码本文所述的ADAR1多肽或其特征性部分。在一些实施例中，工程化的细胞、胚胎、非人动物的基因组包含多核苷酸，其序列编码本文所述的ADAR1多肽或其特征性部分。在一些实施例中，工程化的非人动物的种系基因组包含多核苷酸，其序列编码本文所述的ADAR1多肽或其特征性部分。
[0008]在一些实施例中，本披露提供了经遗传修饰的啮齿类动物。在一些实施例中，所提供的经遗传修饰的啮齿类动物是大鼠或小鼠。在一些实施例中，所有内源序列都是大鼠或小鼠序列。例如，在一些实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物是小鼠，所有内源序列都是小鼠序列。在一些实施例中，经遗传修饰的啮齿类动物是大鼠，并且所有内源序列都是大鼠序列。
[0009]在一些实施例中，本披露提供了本文提供的经遗传修饰的啮齿类动物的繁殖群体，其包括第一经遗传修饰的啮齿类动物、第二经遗传修饰的啮齿类动物和第三经遗传修饰的啮齿类动物，其中该第一、第二和第三经遗传修饰的啮齿类动物均为本文所述的经遗传修饰的啮齿类动物。在一些实施例中，第三经遗传修饰的啮齿类动物是第一经遗传修饰的啮齿类动物和第二经遗传修饰的啮齿类动物的后代。
[0010]在一些实施例中，工程化的细胞、胚胎、非人动物等是杂合的。在一些实施例中，工程化的细胞、胚胎、非人动物等是纯合的。
[0011]在一些实施例中，本披露提供了用于制造工程化的细胞、胚胎、非人动物等的技术。在一些实施例中，本披露提供了用于评估/表征工程化的细胞、胚胎、非人动物等的技术。
附图说明
[0012]这里包括的附图由以下附图组成，仅用于说明目的，而非限制。
[0013]图1显示了用于构建生成根据本披露的非人动物的实施例中使用的靶向载体(在实例1中描述)的策略的示例性实施例的图示，未按比例绘制。“LR”表示靶向ROSA26基因座
的由SEQ ID NO:62所示的5'同源臂，“腺病毒剪接受体”表示如由SEQ ID NO:57所示的剪接受体，“CDS”表示由SEQ ID NO:14所示的ADAR1 p110基因座序列，“WPRE”表示由SEQ ID NO:56所示的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件，“bGH聚(A)信号”表示由SEQ ID NO:59所示的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经工程化为包含人ADAR1多肽或其特征性部分的非人动物，一种经工程化为包含和/或表达多核苷酸的非人动物，该多核苷酸的序列编码人ADAR1多肽或其特征性部分。2.一种经工程化为包含ADAR1多肽或其特征性部分的非人动物，或一种经工程化为包含和/或表达多核苷酸的非人动物，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。3.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物的基因组包含多核苷酸，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。4.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物的种系基因组包含多核苷酸，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。5.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物经工程化为表达ADAR1多肽或其特征性部分。6.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的表达在一个或多个细胞和/或组织中是可诱导的。7.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的表达在一个或多个细胞和/或组织中是组成型的。8.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的表达是组织特异性的。9.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物是啮齿类动物。10.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物是小鼠。11.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物是大鼠。12.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含脱氨酶结构域。13.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含一个或多个(例如，1、2、3或更多个)dsRBD。14.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含一个或多个(例如，1、2、3或更多个)Z
‑
DNA结合结构域。15.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含灵长类动物ADAR1多肽或其片段的氨基酸序列、灵长类动物ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列，和/或灵长类动物ADAR1多肽的氨基酸序列，或该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是灵长类动物ADAR1多肽的氨基酸序列。16.如权利要求2
‑
15中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是灵长类动物ADAR1多肽。17.如权利要求2
‑
16中任一项所述的动物，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1多肽。18.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1的p110同种型。19.如权利要求1
‑
17中任一项所述的动物，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1的p150同种型。20.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该ADAR1多肽或其特征性部分，当与靶向靶腺苷的寡核苷酸组合物接触时，在该工程化的动物的一个或多个细胞或组织中提供与
在参考动物的相应细胞或组织中观察到的水平(“参考编辑水平”)相比增加的该靶腺苷的编辑水平(“工程化的编辑水平”)，其中该参考动物未经工程化为表达该ADAR1多肽或其特征性部分。21.如权利要求20所述的动物，其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38700、WV
‑
38702或WV
‑
40590，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠UGP2转录物中靶向的腺苷，和/或其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
40592，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠SRSF1转录物中靶向的腺苷，和/或其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38697或WV
‑
38699，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠EEF1A1转录物中靶向的腺苷。22.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该一个或多个细胞或组织是肝组织，或其中该一个或多个细胞或组织是小鼠肝细胞。23.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该工程化的编辑水平是该参考编辑水平的约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或更多倍。24.如前述权利要求中任一项所述的动物，其中该动物是杂合的。25.如权利要求1
‑
24中任一项所述的动物，其中该动物是纯合的。26.一种经工程化为包含ADAR1多肽或其特征性部分的非人胚胎，或一种经工程化为包含和/或表达多核苷酸的非人胚胎，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。27.如前述权利要求中任一项所述的胚胎，其中该胚胎的基因组包含多核苷酸，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分，和/或其中该胚胎经工程化为表达ADAR1多肽或其特征性部分，和/或其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含脱氨酶结构域，和/或其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含一个或多个(例如1、2、3或更多个)dsRBD，和/或一个或多个(例如1、2、3或更多个)Z
‑
DNA结合结构域。28.如前述权利要求中任一项所述的胚胎，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含灵长类动物ADAR1多肽或其片段的氨基酸序列，任选地其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1多肽，或其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1的p110同种型，或者是人ADAR1的p150同种型。29.如前述权利要求中任一项所述的胚胎，其中该ADAR1多肽或其特征性部分，当与靶向靶腺苷的寡核苷酸组合物接触时，在一个或多个经工程化为表达该ADAR1多肽或其特征性部分的细胞和/或组织中提供与在未经工程化为表达该ADAR1多肽或其特征性部分的参考细胞或组织中观察到的水平相比增加的该靶腺苷的编辑水平(“工程化的编辑水平”)，任选地其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38700、WV
‑
38702或WV
‑
40590，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠UGP2转录物中靶向的腺苷，和/或其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
40592，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠SRSF1转录物中靶向的腺苷，并且其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38697或WV
‑
38699，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠EEF1A1转录物中靶向的腺苷，并且任选地其中该工程化的编辑水平是该参考编辑水平的约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或更多倍。30.如前述权利要求中任一项所述的胚胎，其中该胚胎是杂合的。31.如权利要求26
‑
30中任一项所述的胚胎，其中该胚胎是纯合的。32.一种经工程化为包含ADAR1多肽或其特征性部分的细胞，或一种经工程化为包含和/或表达多核苷酸的细胞，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。
33.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该细胞是非人细胞。34.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该细胞是胚胎干细胞。35.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该细胞的基因组包含多核苷酸，该多核苷酸的序列编码ADAR1多肽或其特征性部分。36.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含脱氨酶结构域。37.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含一个或多个(例如1、2、3或更多个)dsRBD，和/或一个或多个(例如1、2、3或更多个)Z
‑
DNA结合结构域。38.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含灵长类动物ADAR1多肽或其片段的氨基酸序列。39.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含灵长类动物ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列。40.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1多肽。41.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1的p110同种型，或者是人ADAR1的p150同种型。42.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该ADAR1多肽或其特征性部分，当与靶向靶腺苷的寡核苷酸组合物接触时，在一个或多个经工程化为表达该ADAR1多肽或其特征性部分的细胞和/或组织中提供与在未经工程化为表达该ADAR1多肽或其特征性部分的参考细胞或组织中观察到的水平相比增加的该靶腺苷的编辑水平(“工程化的编辑水平”)。43.如权利要求42所述的细胞，其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38700、WV
‑
38702或WV
‑
40590，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠UGP2转录物中靶向的腺苷，和/或其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
40592，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠SRSF1转录物中靶向的腺苷，和/或其中该寡核苷酸组合物是WV
‑
38697或WV
‑
38699，并且该靶腺苷是该寡核苷酸组合物在人或小鼠EEF1A1转录物中靶向的腺苷。44.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该一个或多个细胞或组织是肝组织。45.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该一个或多个细胞或组织是小鼠肝细胞。46.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该工程化的编辑水平是该参考编辑水平的约或至少约1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、100或更多倍。47.如前述权利要求中任一项所述的细胞，其中该细胞是杂合的。48.如权利要求32
‑
46中任一项所述的细胞，其中该细胞是纯合的。49.如前述权利要求中任一项所述的动物、胚胎或细胞，其中ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含以下序列，该序列与SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40相同，差异不超过1
‑
10(例如，1
‑
8、1
‑
5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个氨基酸，或具有约或至少约90％
‑
100％(例如，90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)同源性，和/或其中ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含SEQ IDNO:27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40，和/或其中ADAR1多肽或其特征性
部分的氨基酸序列是或包含SEQ IDNO:5、6、9、12、16、20、26、43、46、49、52或55，或其特征性部分。50.如前述权利要求中任一项所述的动物、胚胎或细胞，其中该动物、胚胎或细胞包含与病症、障碍或疾病相关的G至A突变。51.如前述权利要求中任一项所述的动物、胚胎或细胞，其中该动物、胚胎或细胞包含对应于人SERPINA1基因中的1024G>A(E342K)突变的G至A突变。52.一种多核苷酸，其包含：a)编码ADAR1多肽或其特征性部分的ADAR1多核苷酸，b)ADAR1多核苷酸上游的5'同源臂，和c)ADAR1多核苷酸下游的3'同源臂，其中该5'和3'同源臂独立地包含分别对应于非人动物基因组中的5'和3'靶序列的核苷酸序列，其中该5'靶序列在该3'靶序列的上游。53.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中该ADAR1多核苷酸经密码子优化以在动物宿主细胞中表达ADAR1多肽或其特征性部分。54.如权利要求53所述的多核苷酸，其中该动物是小鼠或大鼠。55.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含脱氨酶结构域。56.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中该ADAR1多肽或其特征性部分是或包含一个或多个(例如1、2、3或更多个)dsRBD，和/或一个或多个(例如1、2、3或更多个)Z
‑
DNA结合结构域。57.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中该ADAR1多肽或其特征性部分的氨基酸序列是或包含灵长类动物ADAR1多肽或其片段的氨基酸序列。58.如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸，其中该灵长类动物ADAR1多肽是人ADAR1多肽。59.如前述权利要求中任一项...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海林，普拉尚，
申请(专利权)人：波涛生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：